富GABA米糠改善大鼠氧化应激和肝功能损伤

周中凯，刘志伦，张惠媛

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

富GABA米糠改善大鼠氧化应激和肝功能损伤

周中凯，刘志伦，张惠媛

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

研究富伽马氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）米糠有效改善高脂饮食诱发大鼠氧化应激和肝功能损伤。添加GABA前体物L-谷氨酸，通过原米糠中脱酸酶转化获得富GABA米糠，其中GABA的含量由32mg/100 g升高至242mg/100 g。原米糠、富GABA米糠分别添加到高脂饲料，试验大鼠分为正常对照组、高脂饲料组、普通米糠组和富GABA米糠组，考察普通米糠、富GABA米糠对高脂饮食大鼠的体重、肝指数、肝功能及氧化应激的影响。富GABA米糠组大鼠体重明显低于高脂饲料组大鼠和普通米糠组大鼠（p＜0.5），富GABA米糠在减轻肝脏细胞脂肪变性、降低转氨酶及碱性磷酸酶、改善肝脏氧化应激等方面优于普通米糠组大鼠。

普通米糠；富GABA米糠；高脂饮食；肝功能；氧化应激

随着人们的生活水平的不断提高，与之伴随的高脂饮食成为了普遍现象，由此引发的肥胖、高血压、代谢综合症、非酒精脂肪肝等疾病也越来越多，威胁人们的身体健康[1-3]。特别是肥胖，不仅增加心血管疾病、糖尿病、慢性肾脏疾病等疾病患病率[4-6]，而且易引起脂肪肝，引发肝脏脂肪代谢紊乱及造成肝功能受损[7]，降低体重是保持肝脏健康的重要策略之一，而传统药物都过于昂贵或副作用大，因此通过食物干预有效控制体重与改善肝脏功能成为研究热点之一。

米糠做为稻米生产的副产物，含有低致敏性蛋白、纤维素、谷维素、神经酰胺、二十八烷醇、生育三烯酚等多种天然活性成分及抗氧化物质[8-9]。伽马氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种从细菌到植物和脊椎动物普遍存在的非蛋白质氨基酸[10]。它可以由L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来，是一种重要的抑制性神经递质[11]。同时也具有降低血脂的功能，及改善氧化应激、改善肝肾功能的作用[12]，而在普通米糠中GABA含量较低，其功能性表达较弱，为此本试验尝试添加GABA的前体物质（L-谷氨酸），通过新鲜米糠谷氨酸脱羧酶的转化作用，提升GABA的含量，使米糠中GABA的含量由32mg/100 g升高至242mg/ 100 g。同时分析在提升米糠GABA含量过程中其他活性化合物，如酚酸化合物等的含量变化情况，以及米糠抗氧化活性的变化。在获得富GABA米糠之后，本文将同高脂饮食的动物模型研究原米糠和富GABA米糠在调控及改善由于高脂饮食对大鼠代谢失衡所引发的副作用，对于进一步开发和利用米糠资源提供一条新思路。

1 材料与方法

1.1 动物和饲料

新鲜米糠：国家粳稻工程技术中心提供。

SPF级雄性健康Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，中国人民解放军军事医学院实验动物中心购入，体重140 g～150 g，实验动物生产许可证号：SCXK-（军）2012-0004。大鼠基础饲料配方：粗蛋白≥18.0%，粗纤维≤5.0%，粗脂肪≥4.0%，灰分≤8.0%，水分≤10.0%，钙1.0%～1.8%。高脂饲料配方：63.8%基础饲料、10%蔗糖、10%蛋黄粉、0.2%胆酸钠、15%猪油、1%胆固醇。

1.2 材料与试剂

总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）的检测试剂盒：均购于南京建成生物工程研究所。

1.3 米糠的培养与干燥

富GABA米糠[13]：新鲜米糠用5mmol/L的谷氨酸水溶液把水分调至30%，装袋后充入氮气密封，放入恒温培养箱中，40℃下培养5 h。培养后真空进行干燥（50℃，12 h）。干燥后打碎，冷藏备用。

1.4 动物分组及处理方法

基础饲料喂养一周，40只SD大鼠分为4组，分别为正常对照组（普通饲料），高脂饲料组（高脂饲料），普通米糠组（85%高脂饲料+15%普通米糠）、富GABA米糠组（85%高脂饲料+15%富GABA米糠）。4组大鼠均自由进水进食，温度20℃～25℃，湿度50%～55%。每周测量体重。

1.5 指标检测

1.5.1 血清标本采集

干预8周后，禁食12 h，腹主动脉取血，血样室温静置2 h后，4 000 r/min离心10min，取血清于-80℃贮存备用。

1.5.2 肝重及肝指数测定

解剖取出大鼠肝脏后，用滤纸吸干表面水分称重，肝指数：肝指数/%=肝重量（g）/体重（g）×100。

1.5.3 肝组织形态学观察

切取部分肝组织以10%的中性福尔马林溶液固定，石蜡切片，HE染色，Leica光学显微镜观察大鼠肝脏观察肝组织状态。

1.5.4 肝功能指标测定

按照测试盒的说明书测定血清中AKP、ALT、AST含量。

1.5.5 氧化应激水平

按照测试盒的说明书测定血清中T-SOD、GSHPX、MDA及T-AOC水平。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 19.0统计软件进行处理数据，结果均以均值±标准差（±sD）表示，采用单向方差分析，以p＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 普通米糠、富GABA米糠对高脂饮食大鼠体重的影响

喂食8周后，4组大鼠的最终体重见图1。

图1 4组大鼠体重Fig.1 Weightof 4 groupsof rats

由图1可以看出，高脂饲料组大鼠体重增加明显（p＜0.05），体重远高于正常对照组大鼠体重（p＜0.05）。分别使用普通米糠、富GABA米糠对高脂饲料大鼠进行干预，普通米糠组大鼠和高脂饮食组大鼠体重并无差异，但富GABA米糠组大鼠对比高脂饲料组大鼠，体重降低显著（p＜0.05），已接近正常对照组大鼠，说明富GABA米糠具有控制大鼠体重效果。

2.1 普通米糠、富GABA米糠对高脂饮食大鼠肝重、肝指数的影响

肝指数是衡量动物肝脏健康的一项重要指标，大鼠肝重及肝指数见表1。

表1 各组大鼠肝重及肝指数Table1 Liverweightand liver index of 4 groupsof rats

由表1可以看出高脂饮食的长期摄入，高脂饲料组大鼠肝指数升高明显（p＜0.05）。普通米糠组大鼠肝重及肝指数小幅下降，富GABA米糠组大鼠的肝重和肝指数显著降低（p＜0.05），趋近正常对照组，说明富GABA米糠在维持肝重正常，降低脂肪肝方面有积极作用。

2.2 大鼠肝组织形态学观察

使用徕卡光学显微镜观察各组大鼠肝脏组织切片见图2。

图2 4组大鼠肝脏切片观察Fig.2 Liver slicesobservation of 4 groupsof rat

如图2所示，正常对照组大鼠肝细胞大小一致，分布密布有序，血管周围呈放射状，肝索整齐有序，细胞内未见脂肪滴。高脂饲料组大鼠肝细胞排列不规则，大小不一的脂肪泡充斥在细胞内，部分细胞被脂肪溶解，血管周围分布杂乱无序。普通米糠组老鼠干燥切片脂肪泡数量减少，面积减小，被溶解的细胞数量减少。富GABA米糠组大鼠肝脏细胞受损程度进一步减轻，细胞核较为清晰，细胞排列向有序化发展，血管周围呈放射状，整体水平趋向于正常老鼠肝脏。

2.3 普通米糠、富GABA米糠对肝功能指标的影响

动物体血清的转氨酶、碱性磷酸酶可以检测肝脏受损程度，肝功能指标见表2。

表2显示，与正常对照组相比，高脂饲料组、普通米糠组、富GABA米糠组大鼠的谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）含量均有所增加，特别是ALT和AKP增加显著（p＜0.05）。ALT主要存在于肝细胞浆内，只要有1%的肝细胞被破坏时，就会使血清内ALT增高一倍，ALT为检测肝功能损害敏感的指标。因此3组大鼠的肝脏都有损伤，普通米糠和富GABA米糠干预后，ALT、AST和AKP均有不同程度的降低，其中富GABA米糠组的ALT水平已经趋近正常水平（p＞0.05），在改善肝功能指标方面优于普通米糠。

表2 肝功能指标统计表Table2 The liver function index

2.4 普通米糠、富GABA米糠对肝脏氧化应激的影响

4组大鼠的氧化应激指标见表3。

表3 各组大鼠氧化应激水平统计表Table3 Theoxidativestress levelof groups’rats

喂食大鼠8周后，高脂饲料组大鼠血清中总抗氧化能力（T-AOC）降低，普通米糠组大鼠小幅上升，富GABA米糠干预后，总抗氧化能力提升明显（p＜0.05），与正常对照组无差异。由于受高脂饮食的刺激，除正常组外，总超氧化物歧化酶（T-SOD）含量都有升高，经过干预后，富GABA米糠组大鼠T-SOD明显高于高脂饲料组大鼠（p＜0.05）。在GSH-Px水平恢复方面，3组老鼠未表现出差异性。丙二醛（MDA）含量方面，高脂饲料组升高显著（p＜0.05），两组米糠组大鼠的MDA都有降低，但富GABA米糠组趋近于正常组水平（p＜0.05）。

3 结论

越来越多的研究表明高脂饮食引起的肥胖呈现低龄化趋势，高脂饮食的长期摄入易引起肥胖[14]。从而引起脂肪肝损伤肝脏，产生氧化应激，本研究中表明摄入高脂饲料的大鼠体重显著高于正常对照组，肝指数提升明显，血清转氨酶和碱性磷酸酶显著升高，证实了大鼠肝脏脂肪变性，通过大鼠肝脏切片形态学观察，进一步证实肝功能发生损伤。实验结果与报道的高脂饮食导致脂肪肝及肝功能损伤一致[15]。

高脂饲料中添加定量普通米糠和富GABA米糠对大鼠进行干预，与高脂饮食大鼠对比，均能降低大鼠体重和肝指数，其中富GABA米糠干预效果显著。通过观察4组肝脏组织形态，证实两组米糠组大鼠脂肪泡减少、变小，细胞变性减轻，其中富GABA米糠组趋近于正常组水平。两组米糠组大鼠的转氨酶和碱性磷酸酶降低，减轻了高脂饮食对肝脏的损伤。综合各项指标来看，富GABA米糠的效果好于普通米糠的效果。其中富GABA米糠中富集的GABA起到关键作用，谢振兴等[16]也证实GABA在减轻高脂饮食对肝脏的损害，改善肝脏组织中脂肪沉积和恢复转氨酶水平方面具有显著效果。

长期高脂饮食引起的脂肪肝影响氧化应激水平，同时氧化应激是脂肪肝恶化的重要原因之一[17]，表现在抗氧化能力减弱，抗氧化酶减少，直接导致机体清除自由基能力减弱。过剩的自由基破坏细胞及生命大分子（DNA、RNA、蛋白质、脂质、糖类），对组织造成损伤，引发代谢紊乱，影响肝脏的功能[18]。高脂饮食影响大鼠T-AOC和SOD水平，T-AOC表现在机体总抗氧化能力的强弱[19]，SOD可以有效消除氧自由基，催化超氧阴离子的歧化反应，降低超氧阴离子对机体组织造成的损伤，MDA可直接反映自由基产生的量及机体被氧化程度。普通米糠和富GABA米糠干预后，两组大鼠T-AOC和SOD水平提升，MDA的含量降低，且富GABA米糠组的T-AOC，SOD水平增加明显（p＜0.05）。同时，体外实验表明富GABA米糠表现出了较强抗氧化能力，米糠中含有的酚类和酮类等小分子活性物质可增加抗氧化能力，培养过的米糠中酚酸种类与含量都有升高，是抗氧化能力强于普通米糠的原因之一。综合表明富GABA米糠能有效抑制大鼠过氧化水平，改善氧化应激，且效果优于普通米糠。

[1]Castro IA,Tirapegui J,BenedictoM L.Effectsofdietsupplementation with three soluble polysaccharides on serum lipid levels of hypercholesterolemic rats[J].Food Chemistry,2003,80(3)：323-330

[2]IDvir,R Chayoth.Soluble polysaccharide and biomass of red microalga Porphyridium sp.alter intestinal morphology and reduce serum cholesterol in rats[J].British Journal of Nutrition,2000,84 (4)：469

[3]BURROUGHS PEÑA M S,PATEL D,RODRÍGUEZ L D,et al. Lifestyle risk factorsand cardiovascular disease in cubansand cuban americans[J].CardiologyResearch&Practice,2012(9)：470705

[4]Parker DR,Weiss ST,TroisiR,et al.Relationship of dietary saturated fatty acids and body habitus to serum insulin concentrations：the Normative Aging Study[J].American Journalof Clinical Nutrition,1993,58(2)：129-136

[5]Haslam DW,JamesWP.Obesity[J].Lancet,2005,366(9492)：1197-1209

[6]Pinhal C S,Lopes A,Torres D B,etal.Time-coursemorphological and functional disorders of the kidney induced by long-term highfat diet intake in female rats[J].Nephrology Dialysis Transplantation,2013,28(10)：2464-2476

[7]黄英,李雪兰,蒋凤荣.白藜芦醇对非酒精性脂肪肝大鼠的作用机制研究[J].南京中医药大学学报,2011,27(4)：366-367

[8]唐传核.米糠油来源生育三烯酚生理功能作用[J].粮食与油脂, 2000(2)：35-36

[9]龚院生,姚惠源,杭敏.米糠水溶性提取物中γ-谷维醇的富集和米糠保健饮料工艺研究[J].食品科学,2001(3)：47-49

[10]Fromm H.GABA in plants：justametabolite[J].Trends in PlantScience,2004,9(3)：110-115

[11]张辉,徐满英.氨基丁酸作用的研究进展[J].哈尔滨医科大学学报,2006,40(3)：267-268

[12]Takahashi T,Furukawa A,Hara S,etal.Isolation and characterization of sakeyeastmutants deficient inγ-aminobutyric acidutilization in sake brewing[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004,97(6)：412-418

[13]Reubi JC,Berg CV D,Cuénod M.Glutamine as precursor for GABA and glutamate transmitter pools[J].Neuroscience Letters,1978, 10(1/2)：171-174

[14]Torun E,Gökçe S,OzgenT,et al.Serum paraoxonase activity and oxidative stressand their relationship with obesity-relatedmetabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease in obese children andadolescents[J].JournalofPediatricEndocrinologyandMetabolism, 2016,27(7/8)：667-675

[15]Li S,Liao X,Meng F,etal.Therapeutic roleofursolic acid on ameliorating hepatic steatosis and improving metabolic disorders in high-fatdiet-induced non-alcoholic fatty liver disease rats[J].PLoS One,2014(1)：86724

[16]谢振兴,李秀,耿旭,等.伽马氨基丁酸抑制高脂诱导肥胖小鼠肝脏氧化应激及肝脂肪变性[J].食品与生物技术学报,2015(6)：613-620

[17]Mantena SK,King A L,Andringa K K,et al.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the pathogenesisofalcoholand obesity induced fatty liver diseases[J].Free Radic Biol Med,2008,44 (7)：1259-1272

[18]刘颐轩,宋桉,王芸,等.氧化应激在肥胖及胰岛素抵抗中的作用研究进展[J].解放军医药杂志,2014,26(1)：99-101

[19]PANDeng,ZHANGDang,WU Jiasheng,etal.Antidiabetic,antihyperlipidemic and antioxidantactivitiesof a novel proteoglycan from Ganoderma lucidum fruiting bodies on db/dbmice and the possible mechanism[J].PLoSOne,2013,8(7)：1-10

The Improvement in Oxidative Stress and Liver Function Damage in Rats by GABA-enriched Rice Bran

ZHOU Zhong-kai，LIU Zhi-lun，ZHANGHui-yuan
（Collegeof Food Engineeringand Biotechnology，Tianjin University of Scienceand Technology，Tianjin 300457，China）

High-fat diet induced oxidative stress and liver function injury in rats were effectively improved through investigatingGABA-enrich ricebran.Thenatural ricebranwas transformed into theGABA-enrich rice bran by virtue ofaminobutyric acid enzyme，which was acquired by adding GABA precursor substance L-Glutamic acid into it.Itwas clearly found that the contentof GABA increased from 32mg/100 g to 242mg/100 g. Firstly，the natural rice bran and GABA-enrich rice bran were added into the high fat feedstuff respectively. Then，the effectsofGABA-enrich rice bran on high-fatdiet ratsweight，liver function and even oxidative stress were studied，the experimental rats were divided into four categories-normal control group，high-fat feed group，natural rice bran，and GABA-enrich rice bran group.Finally，itwas revealed that the ratweight in GABA-enrich rice bran group was lower than high fat fee group rats and natural rice bran group rats（P＜0.5）. Therefore，itwas proved that the GABA-enrich rice was superior to the natural rice bran in reducing liver steatosiscells，aminotransferase，alkaline phosphataseand in improving liveroxidativestress.

naturalricebran；GABA-enrich ricebran；high fatdiet；liver function；oxidativestress

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.035

2016-06-21

科技部农业科技成果转化（2014GB2A100527）；国家星火计划项目（2015GA610003）

周中凯（1964—），男（汉），教授，博士，研究方向：谷物科学与营养。