原花青素白藜芦醇浆亚慢性毒性评价及抗氧化功能研究

杨艳，张扬，汪春梅，陈璐，何华蓥，温敏，谢惠波,*

（1.西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，四川泸州646000；2.西南医科大学公共卫生学院，四川泸州646000）

原花青素白藜芦醇浆亚慢性毒性评价及抗氧化功能研究

杨艳1，张扬1，汪春梅1，陈璐2，何华蓥2，温敏2，谢惠波1,*

（1.西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，四川泸州646000；2.西南医科大学公共卫生学院，四川泸州646000）

评价原花青素白藜芦醇浆亚慢性毒性，并初步研究其抗氧化功能，为开发其保健功效提供科学依据。采用大鼠90天喂养试验对原花青素白藜芦醇浆的亚慢性毒性进行评价，并在实验末采血测定血清抗氧化指标。90天喂养试验结果显示花青素白藜芦醇浆对大鼠各项指标未产生毒副作用，其最大无作用剂量（NOAEL）大于7.5 g/kg·BW。雌、雄大鼠各剂量组血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平均有2个～3个剂量组显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），高剂量组雌、雄大鼠血清丙二醛（MDA）含量低于对照组（P＜0.01）。原花青素白藜芦醇浆在本实验条件下未见有亚慢性毒性，血清抗氧化指标检测结果提示原花青素白藜芦醇浆具有一定抗氧化功能。

原花青素白藜芦醇浆；亚慢性毒性；大鼠；血清；抗氧化

野生山枇杷，又名皱叶荚蒾、枇杷叶荚蒾、山枇杷、毛羊屎树、野枇杷、黑汉条子等，属忍冬科荚蒾属植物，一般高4米，生命力旺盛，耐旱、耐热、耐涝，花期4月～5月，果熟期9月～10月。根据有关古籍记载，具有一定的保健功效。以野生山枇杷为主要原料的原花青素白藜芦醇浆（因检测含有原花青素和白藜芦醇而命名）被研制成功，经近5年的少量志愿者人群试用，未发现不良反应。为了解原花青素白藜芦醇浆大剂量及长期食用是否安全，本研究选择90天喂养试验评价其亚慢性毒性，并对其抗氧化功能进行初步研究，为其保健食品的阐明提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 受试物

原花青素白藜芦醇浆，为暗红色的粘稠液体，由四川省古蔺县吉利果品有限公司提供，其生产工艺已获得国家发明专利。

1.2 实验动物

清洁级健康SD大鼠（80只，体重90 g～110 g，雌雄各半。）：由由西南医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证SCXK（川）2013-17；实验动物使用许可证SYXK（川）2013-06。动物饲养环境温度20℃～25℃、相对湿度50%～70%。

1.3 仪器与试剂

BC-6900全自动血液细胞分析仪：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；SELECTRA Junior全自动生化分析仪：荷兰威图公司；Versamax连续波长酶标仪：美国分子仪器公司。

谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、血糖（Glu）、总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）和白蛋白（Alb）测定试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 动物分组方法[1]

大鼠适应性喂养7 d后，将动物随机分成4组：即低、中、高剂量组和对照组，每组20只，雌雄各半。原花青素白藜芦醇浆低、中、高剂量组分别按人推荐剂量的50、100、150倍按2.5、5.0、7.5 g/kg·BW剂量的原花青素白藜芦醇浆灌胃90 d，对照组给予等体积纯净水。每天每只大鼠按1mL/100g·BW定时经口灌胃。连续喂养90 d。实验期间所有动物单笼饲养，自由进食、饮水。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 一般情况、体重及食物利用率

每日观察动物的一般活动、症状和死亡情况，每周记录体重和进食量并计算食物利用率。

1.5.2 血常规、血清生化指标、血清抗氧化功能指标检测

实验期末各组大鼠禁食16 h，准确称取大鼠体重，按体重腹腔注射2%戊巴比妥钠45mg/kg（2.25ml/kg）麻醉，腹主动脉采血，进行血常规检测，离心分离血清进行血清生化指标、抗氧化功能相关指标的检测。

1.5.3 脏器重量、脏器系数及病理组织学观察

采血后，取肝、肾、脾、胃、十二指肠和性腺（睾丸或卵巢）进行大体解剖学观察，并对大鼠脏器进行称重，根据公式计算其脏器系数：脏器系数/%=脏器重量/体重×100。然后以10%甲醛固定，按常规切片、HE染色，进行病理组织学检查。

1.6 统计方法

所有数据用EpiData3.0建立的数据库进行数据录入，采用SPSS22.0统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，各指标采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠生长发育的影响

实验期间各组大鼠生长良好，一般状况如行为、活动、毛色光泽、精神状况、饮水及粪便均未见明显异常。雌、雄鼠试验期间体重增长值、进食量、食物利用率总体比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠体重变化及进食情况Table1 Weightgain and food-intakeof rats in 90-days feeding test（n=10，±s）

表1 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠体重变化及进食情况Table1 Weightgain and food-intakeof rats in 90-days feeding test（n=10，±s）

性别剂量/（g/kg·BW）增重/g进食量/g食物利用率/%雄对照组331.0±36.0 2 012.3±41.6 16.4±1.7 2.5 305.6±35.8 2 006.3±28.7 15.2±1.6 5.0 309.4±25.3 1 985.6±29.4 15.6±1.2 7.5 307.5±25.1 1 987.0±40.4 15.5±1.2雌对照组172.6±18.3 1 649.4±42.9 10.6±1.2 2.5 162.3±14.4 1 619.8±38.6 9.9±0.8 5.0 168.9±27.2 1 610.1±44.6 10.5±1.7 7.5 161.7±11.2 1 597.6±29.7 10.1±0.7

2.2 对大鼠血液学指标的影响

各项血常规指标总体比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验末期各组大鼠血常规指标检查结果Table2 Routineblood cellexam ination at theend of 90-days feeding test（n=10，±s）

表2 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验末期各组大鼠血常规指标检查结果Table2 Routineblood cellexam ination at theend of 90-days feeding test（n=10，±s）

性别剂量/（g/kg·BW）白细胞/（109个/L）红细胞/（1012个/L）血红蛋白/（g/L）血小板/（109个/L）淋巴细胞/%雄对照组4.95±1.44 8.53±0.36 155.40±7.45 1045.00±104.31 76.98±6.31 2.5 5.18±1.74 8.42±0.22 151.70±3.71 1057.20±90.33 71.60±5.42 5.0 6.58±2.04 8.38±0.26 153.80±4.57 967.50±151.47 71.76±7.32

续表2 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验末期各组大鼠血常规指标检查结果Continut table2 Routineblood cellexam ination at theend of90-days feeding test（n=10，±s）

续表2 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验末期各组大鼠血常规指标检查结果Continut table2 Routineblood cellexam ination at theend of90-days feeding test（n=10，±s）

性别剂量/（g/kg·BW）白细胞/（109个/L）红细胞/（1012个/L）血红蛋白/（g/L）血小板/（109个/L）淋巴细胞/%雄7.5 6.46±2.05 8.52±0.29 153.50±6.58 1 007.40±121.50 71.24±8.34雌对照组3.18±0.77 7.52±0.28 141.90±3.45 994.80±101.25 71.54±4.49 2.5 3.96±2.16 7.54±0.46 145.10±6.24 983.70±75.90 73.60±4.38 5.0 4.54±1.61 7.55±0.21 141.10±4.43 1 006.30±108.26 74.38±5.83 7.5 4.19±1.20 7.57±0.29 144.10±6.33 1 007.80±103.36 74.77±7.94

2.3 对大鼠生化指标的影响

实验末各项血生化指标总体比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 对大鼠脏体比值的影响

各剂量组大鼠的脏体比与对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05），见表4，表明该样品对大鼠的脏器/体重比值无显著影响。

表3 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠血清生化指标检查结果Table3 Serum biochem icalanalysis in 90-days feeding test（n=10，±s）

表3 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠血清生化指标检查结果Table3 Serum biochem icalanalysis in 90-days feeding test（n=10，±s）

性别剂量/（g/kg·BW）血糖/（mmol/L）雄对照组59.57±2.40 29.30±2.01 1.25±0.22 0.57±0.15 65.46±11.42 175.64±49.62 6.02±1.15 40.25±13.14 6.48±1.37 2.5 57.22±2.57 28.06±2.07 1.17±0.26 0.64±0.16 65.79±6.72 168.79±42.89 6.15±1.10 36.21±14.55 6.25±1.27 5.0 57.36±1.77 28.06±0.70 1.08±0.11 0.48±0.22 65.31±4.00 190.21±25.35 6.16±0.68 38.70±15.94 5.48±0.77 7.5 57.84±3.52 28.43±1.82 1.17±0.18 0.58±0.11 64.04±5.42 193.70±36.79 6.17±0.65 44.20±13.92 5.75±1.17雌对照组64.61±4.94 33.37±2.64 1.27±0.31 0.48±0.08 63.14±12.48 180.38±59.13 5.87±1.12 38.04±14.98 5.26±1.26 2.5 64.41±2.35 32.93±1.67 1.34±0.25 0.51±0.07 61.98±11.59 174.11±37.81 5.98±0.95 44.05±13.95 5.17±1.08 5.0 62.54±5.15 32.51±3.92 1.30±0.25 0.54±0.11 64.18±9.25 200.41±37.77 6.30±1.13 41.05±5.29 4.75±0.74 7.5 60.90±3.29 32.15±2.44 1.42±0.24 0.51±0.06 60.16±5.25 160.98±29.30 5.95±1.24 45.02±9.39 5.58±1.05总蛋白/（g/L）白蛋白/（g/L）总胆固醇/（mmol/L）甘油三酯/（mmol/L）谷丙转氨酶/（U/L）谷草转氨酶/（U/L）尿素氮/（mmol/L）肌酐/（μmol/L）

表4 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠脏器系数Table4 Organ coefficientof ratsin 90-days feeding test（n=10，±s）

表4 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠脏器系数Table4 Organ coefficientof ratsin 90-days feeding test（n=10，±s）

注：-表示无数据。

性别剂量/（g/kg·BW）肝脏系数/%脾脏系数/%肾脏系数/%睾丸系数/%卵巢系数/%雄对照组2.80±0.13 0.16±0.02 0.59±0.03 0.68±0.08-2.5 2.73±0.22 0.17±0.02 0.59±0.06 0.70±0.05-5.0 2.69±0.20 0.17±0.03 0.60±0.04 0.70±0.09-7.5 2.65±0.12 0.16±0.01 0.60±0.04 0.71±0.05-雌对照组3.04±0.35 0.21±0.02 0.65±0.04-0.09±0.02 2.5 2.86±0.12 0.22±0.03 0.60±0.04-0.09±0.02 5.0 2.98±0.22 0.22±0.02 0.63±0.04-0.09±0.02 7.5 2.88±0.23 0.21±0.02 0.62±0.05-0.08±0.01

2.5 大体解剖及组织学检查结果

解剖时大体观察，各剂量组实验大鼠均未见异常改变。病理切片检查发现有对照组和各剂量组个别出现肝细胞轻度脂肪变性，肾间质毛细血管轻度充血，血管旁少许炎细胞侵润，差别无显著性（P＞0.05）；其他器官均未见异常形态学改变。

2.6 血清抗氧化功能

雌、雄大鼠均有2-3个剂量组血清SOD、GSH-Px值显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），高剂量组雌、雄大鼠血清MDA值显著低于对照组（P＜0.01），见表5。表明样品可提高大鼠体内SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平。

3 结论与讨论

本研究通过90天喂养试验对以野生山枇杷为主要原料的原花青素白藜芦醇浆亚慢性毒性进行研究，探讨原花青素白藜芦醇浆长期服用的安全性。试验结果显示：90 d喂养试验期内各剂量组大鼠生长发育良好，体重增重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内[2-3]，与对照组之间差异均无统计学意义，病理组织学检查各剂量组也未发现受试物质造成的病理学改变和损伤。试验各项结果均未显示样品毒作用，最大未观察到有害作用剂量（NOAEL）大于7.5 g/kg·BW，已达人体推荐每日摄入量（3 g/人，为生产者提供的人均量）的150倍，由此可初步认为，在本实验条件下长期服用原花青素白藜芦醇浆对机体并无明显不良反应，是安全的。

表5 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠血清氧化指标检测结果Table5 Serum antioxidant indexes in 90-days feeding test（n=10±s）

表5 原花青素白藜芦醇浆90天喂养试验各组大鼠血清氧化指标检测结果Table5 Serum antioxidant indexes in 90-days feeding test（n=10±s）

注：*与对照组比较差异显著，P＜0.05；**与对照组比较差异极显著，P＜0.01。

性别剂量/（g/kg·BW）MDA/（nmol/mL）雄对照组211.48±31.89 321.74±40.49 8.46±1.20 2.5 231.71±15.36 383.04±51.34*8.41±1.18 5.0 236.64±34.77*411.30±59.60**7.28±1.85 7.5 254.90±13.05**412.83±77.81**5.38±1.23**雌对照组158.21±18.55 351.96±51.16 9.32±1.28 2.5 180.66±13.65*362.83±40.33 8.51±2.25 5.0 178.68±25.97*418.21±92.07*8.72±1.90 7.5 186.71±26.85**428.04±79.08*6.83±1.25** SOD/（U/mL）GSH-Px/（U/mL）

原花青素白藜芦醇浆中含有两大抗氧化成分——原花青素和白藜芦醇，这两大成分均具有抗氧化、调节免疫活性、保肝、抗癌等多种生物活性作用[4-8]。因此，原花青素白藜芦醇浆应具有抗氧化功能，本试验对原花青素白藜芦醇浆的抗氧化功能进行了初步探索。传统的抗氧化试验实验动物为老年大鼠或衰老模型大鼠，本试验旨在探索，所以只检测血清中相应指标，未对其他组织进行检测。本着动物实验“3R”原则，充分利用亚慢性试验结束时的大鼠，检测其体内的抗氧化指标。结果显示，各剂量组雄、雌大鼠血清中SOD、GSH-Px活性均显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），且体现出一定的剂量-反应关系，提示原花青素白藜芦醇浆可以提高大鼠体内抗氧化酶的活性；高剂量组大鼠血清中MDA含量显著低于对照组，提示原花青素白藜芦醇浆可以降低轻大鼠体内的脂质过氧化反应程度。因此，抗氧化指标检测结果提示原花青素白藜芦醇浆发挥保健作用可能与增强机体清除自由基能力，防止脂质过氧化有关。

综合以上结果，可以认为在本试验条件下，原花青素白藜芦醇浆无亚慢性毒性，且具有一定的抗氧化功能。

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Subchronic Toxicity Assessment and Study on the Antioxidant Function of Procyanidins Resveratrol Pulp

YANGYan1，ZHANGYang1，WANGChun-mei1，CHEN Lu2，HEHua-ying2，WENMin2，XIEHui-bo1，*
（1.DepartmentofNutrition and Food Hygiene，SchoolofPublic Health，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.SchoolofPublic Health，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou 646000，Sichuan，China）

To study the subchronic toxicity of procyanidins resveratrolby 90-day feeding test in rats，and to explores the antioxidative function in serum of procyanidins resveratrol pulp.90-day feeding test in ratswas used toassess the subchronic toxicity ofprocyanidins resveratrolpulp，and antioxidant indexes in ratserum were also determined.No obviousadverse effectwasobserved in the 90-day feeding test in rats.No obvious adverse effectswere observed at the dose level of 7.5 g/kg·BW.The activities of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in serum for2-3 dosagegroups in ratswere significantly higher than those in the controlgroup（P＜0.05 or P＜0.01）.Therewas significantdifference onmalondialdehyde（MDA）levelsbetween high groups and the control group（P＜0.05）.Procyanidins resveratrol pulp was not toxic tested by subchronic toxicity.The change of antioxidant indexes in rat serum indicated that the antioxidant function of procyanidins resveratrolpulp.

procyanidinsresveratrolpulp；subchronic toxicity；rat；serum；antioxidant function

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.002

2016-05-16

泸州市-泸州医学院联合基金（2013LZLY-K75）

杨艳（1974—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：食品安全与营养，保健食品研发。

*通信作者：谢惠波（1961—），男，教授，研究方向：保健食品研发。