二硫腙比色法测定核桃多肽口服乳剂中锌含量

吴悠，周涵黎，梅霜，马明兰，谭珺隽，张琳，刘阳，*

（1.武昌理工学院生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北武汉430223；2.武汉工程大学化工与制药学院，湖北武汉430073）

二硫腙比色法测定核桃多肽口服乳剂中锌含量

吴悠1，2，周涵黎1，2，梅霜1，马明兰1，谭珺隽1，张琳1，刘阳1，2，*

（1.武昌理工学院生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北武汉430223；2.武汉工程大学化工与制药学院，湖北武汉430073）

建立测定核桃多肽口服乳剂中锌的二硫腙比色法。利用正交试验确定预处理方法，采用二硫腙一次提取和二次提取法测定乳剂中的锌，并对两种方法的准确度、精密度和线性进行了验证和比较。乳剂试样预处理最佳条件为：硝酸：硫酸体积比为3∶1进行炭化，600℃、8h完全灰化。与一次提取法相比，二硫腙二次提取法测定锌在0～5.0μg/mL范围内浓度与吸光度相关系数为0.999 8（n=6），加标回收率97.21%～102.21%，RSD=2.4%。该法准确度高，精密度好，可用于测定核桃多肽口服乳剂中的锌含量。

核桃多肽；乳剂；锌；二硫腙比色法

我国是以谷类为主食的国家，人群缺锌比较普遍，而在所有坚果中核桃抗氧化物质含量较高，已被证明能够降低Ⅱ型糖尿病发病的风险[1]。核桃多肽口服乳剂由生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心实验室采用干胶法[2]制备，主要由大豆油、复合乳化剂（吐温80、阿拉伯胶、西黄芪胶）以及核桃多肽、锌组成。多肽不仅具有抗氧化、降糖等功能[3]，添加锌可同时促进人体生长发育、增强食欲、增进智力、提高免疫力[4]，是一种多功能保健品。

二硫腙比色法[5]也称双硫腙比色法，是食品科学中检验和分析锌含量的一种常用方法[6-7]。本试验中将分别采用二硫腙比色法一次提取和二次提取来测定核桃多肽口服乳剂中的锌含量，并对分析方法进行验证[8]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

核桃多肽口服乳剂（武昌理工学院生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心实验室提供，批号：20151006，20151103，20151210）；硫酸锌、醋酸钠、醋酸、氨水、盐酸羟胺、硫代硫酸钠、二硫腙、四氯化碳等，以上均为国产分析纯，氧化锌为基准试剂，实验用水为纯化水。

UV-1800紫外-可见分光光光度计：日本，Shimadzu；GZX-9070MBE数显鼓风烘干箱：上海博讯实业有限公司；BS224S电子分析天平：德国，Satorius；UPT-11-10T超纯水仪：成都超纯科技有限公司；SJ-4A pH计：上海精科实业有限公司；SX2-2.5-10GJ马弗炉：湖北英山县建力电炉制造有限公司；HH-S水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 锌标准曲线的绘制

1.2.1.1 一次提取法

吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL锌标准使用液（相当于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg Zn），分别置于125 mL分液漏斗中，各加水至10mL。分别加一滴甲基橙指示液，用浓氨水调至由红变蓝，然后分别加入5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液及1mL硫代硫酸钠溶液（250 g/L），摇匀后，再各加入10.0mL二硫腙-四氯化碳溶液（含二硫腙0.01 g/L），剧烈振摇4min。静置分层后，四氯化碳层经脱脂棉滤入l cm比色杯中，以四氯化碳调节零点，于530 nm处测定吸光度A。

绘制标准曲线，其线性回归方程为：A=0.557c+ 0.026 1（R2=0.991 1），锌标准溶液浓度与吸光度线性关系良好，可用于含量测定。

1.2.1.2 二次提取法

吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL锌标准使用液（相当于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg Zn），分别置于125 mL分液漏斗中，各加盐酸（0.02mol/L）至20mL。然后分别加入10mL醋酸-醋酸钠缓冲液及1mL硫代硫酸钠溶液（250 g/L），摇匀后，再各加入10.0mL二硫腙使用液（含二硫腙0.02 g/mL），剧烈振摇2min。静置分层后，四氯化碳层经脱脂棉滤入1 cm比色杯中，以四氯化碳调节零点，于530 nm处测定吸光度A。

绘制标准曲线，其线性回归方程为：A=0.104 7c-0.100 5（R2=0.999 8），锌标准溶液浓度与吸光度线性关系良好，可用于含量测定。

1.2.2 试样处理与测定

1.2.2.1 炭化

量取5.0mL核桃多肽口服乳剂置于瓷坩埚中，按表1加适量的酸，在水浴上蒸干，以小火炭化直至无烟。

表1 酸的种类及比例的确定（样品量5.0m L）Table1 Determ ination of the typeand proportion of acid（samp lesize5.0m L）

1.2.2.2 灰化

炭化完成后移入马弗炉中灰化8 h后用硝酸、硫酸混合酸进行溶解。设计9组试验，确定最佳灰化条件。9组试验具体条件见表2。

表2 灰化条件试验Table2 Experimentalconditionsof ashing

1.2.2.3 试样制备

灰化后取出坩埚冷却至室温，加入1.5mL～2.0mL混合酸（体积比为硝酸∶硫酸=3∶1），小火加热，不使干涸，必要时加少许混合酸，如此反复处理，直至残渣中无碳粒，待坩埚稍冷，加10mL质量浓度为3.32%的盐酸，溶解残渣并定量转移至50mL容量瓶中，用质量浓度为3.32%的盐酸稀释至刻度，混匀备用。

1.2.2.4 试样测定

样品经消化后，在pH4.0～5.5时，锌离子与二硫腙形成的紫红色络合物可溶于四氯化碳，在530 nm处有最大吸收，与标准系列相比较进行定量。体系中加入硫代硫酸钠，可防止铜、汞、铅、银和镉等离子干扰。

1.2.3 含量测定分析方法的验证

1.2.3.1 准确度——回收率试验

按含量测定浓度的80%、100%、120%设计3个试验浓度，分别按处方比例加入辅料和定量的对照品，每个浓度配制3份供试品溶液，照含量测定方法计算含量，按公式（1）计算加入对照品的回收率。

1.2.3.2 精密度

准确吸取5.0mL消化后定容的样品溶液，平行操作5次，于530 nm处测吸光度，计算RSD值。

1.2.3.3 线性

线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。配制含量测定浓度80%～120%的5份供试品进行一次提取和二次提取，按含量测定方法测定并计算含量。

2 结果与分析

2.1 试样处理

2.1.1 炭化

根据1.2.2.1试样处理中炭化的方法，观察现象，结果见表3。

表3 炭化现象结果Table3 Resultsof carbonization phenomenon

由表3可知，7～9号样品炭化完全，效果较好。因此，炭化时用的混合酸及体积比为硝酸：硫酸（1∶1、2∶1、3∶1）、总用量为0.10mL。

2.1.2 灰化

根据1.2.2.2试样处理中灰化正交试验，观察现象，结果见表4。

表4 试样灰化正交试验结果Table4 Resultsoforthogonalsam pleashing

续表4 试样灰化正交试验结果Continue table4 Resultsof orthogonalsam pleashing

由表4可知，试验8、9灰化效果好，其中试验9灰化结束后得到白色疏松物，效果比试验8更好。因此，灰化最佳条件为：600℃（8 h），硝酸：硫酸体积比为3∶1。

2.2 样品的测定

用确定的炭化和灰化最佳条件，处理核桃多肽口服乳剂试样，分别用一次提取法和二次提取法进行锌含量测定，每个方法测定两次，分别用c1，c2表示测得的浓度，并取平均值，结果见表5。

表5 核桃多肽口服乳剂锌含量测定结果Table5 Walnut polypep tideoralemulsion zinc content determ ination results μg/mL

2.3 分析方法验证

2.3.1 回收率试验

根据1.2.3.1，分别用一次提取和二次提取法测定样品的锌含量，由公式（1）计算回收率，结果见表6和表7。

表6 一次提取结果的回收率Table6 Recovery rateof onceextraction

表7 二次提取结果的回收率Table7 Recovery rateof twiceextraction

由表6和7可知：二次提取的回收率较高，其平均回收率为97.21%～102.21%，准确度较高。

2.3.2 精密度

在确定的试样最佳处理条件下，分别用一次提取和二次提取法测定锌含量，对同一样品重复测定5次，并计算RSD值，结果见表8。

表8 一次提取和二次提取结果的精密度比较Table8 Com parison of precision of onceextraction and twice extraction

紫外-可见分光光度法含量测定要求RSD≤5%[9-11]，由表8可知：二次提取法测定锌的精密度符合要求。

2.3.3 线性

按照1.2.3.3中的方法对80%～120%5个浓度的供试品溶液进行一次提取，其线性回归方程为：y= 1.069 0x-0.373 2（R2=0.978 1）；进行二次提取，其线性回归方程为：y=1.388 0x+0.055 4（R2=0.999 3）。因此，二次提取法的线性较好。

3 结论

试验结果表明，核桃多肽乳剂样品炭化使用混合酸的种类和体积比为硝酸∶硫酸=3∶1，在600℃灰化8 h。锌含量测定中，二次提取法较一次提取具有更高的准确度、精密度和更好的线性，加标回收率为97.21%～102.21%，RSD值为2.4%，小于5%，其线性回归方程相关系数达到0.999以上。因此，可采用二硫腙二次提取法测定核桃多肽口服乳剂中的锌含量。

[1]沙向阳,王纳新,邓欣.多肽药物口服给药的研究进展[J].海峡药学,2012,24(3)：1-5

[2]崔福德.药剂学[M].北京：人民卫生出版社,2013：157-164

[3]王莹,徐秀林,朱乃硕.生物活性肽降血糖功能的研究进展[J].食品科学,2012,33(9)：341-344

[4]于凤池.铁、锌生理功能及稻米中铁、锌含量分布和测定方法的比较研究[J].农业科技通讯,2011(11)：87-88

[5]王竹天,兰真,鲁杰,等.GB/T5009-2003《食品卫生检验方法》理化部分简介[J].中国食品卫生杂志,2005,17(3)：193-211

[6]王少玲,彭翠红.双硫腙-乳化剂OP光度法测定锌的研究[J].韶关学院学报,2014,35(10)：48-51

[7]俞静,李文秀,王雪枫,等.双硫腙分光光度法测定水中微量锌方法的改进[J].天津化工,2014,28(1)：36-39

[8]于治国,宋粉云.分析方法的验证[M].北京：中国医药科技出版社, 2010：213-217

[9]冯东,李雪梅,王丙莲.紫外-可见分光光度法在食品检测及食品安全分析中的应用[J].食品工业,2013,34(6)：190-192

[10]李兰英,郑国金.紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用[J].中国医药指南,2013,11(30)：295-297

[11]苏玉顺,李艳君,赵方振,等.紫外-可见分光光度法在植物多糖含量测定中的应用[J].光谱实验室,2011,28(3)：1101-1107

Determ ination of Zinc Concentration in Walnut Polypeptide Oral Emulsion by Dithizone Colorimetry

WUYou1，2，ZHOUHan-li1，2，MEIShuang1，MAMing-lan1，TAN Jun-jun1，ZHANGLin1，LIUYang1，2，*
（1.Engineering Technology Research Centerof BiologicalPeptide AntidiabeticsofHubeiProvince，Synergy Innovation Centerof BiologicalPeptide AntidiabeticsofHubeiProvince，Schoolof Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China；2.SchoolofChemicalEngineeringand Pharmacy，Wuhan Instituteof Technology，Wuhan 430073，Hubei，China）

To establish themeasurementdithizone colorimetry of zinc concentration in walnutpolypeptide oral emulsion.Orthogonalexperimentwasused to confirm the preparationmethod ofsample，then dithizone once extraction and twiceextractionwere to determine the concentration ofzinc，and the two kindsofdithizoneextractionmethodswere verified and compared from the accuracy，precision and linearity.The emulsion sample was carbonized by usingnitric acid and sulfuric acid（the volume ratiowas3 to1），the ash temperaturewas600℃for8 h.Moreover，compared to dithizone once extractionmethod，when the zinc concentrationwaswithin range of5.0μg/mL，the correlation coefficientofdithizone twice extractionmethod wasup to 0.999 8（n=6），ofwhich the recoverywas 97.21%-102.21%，and the RSD=2.4%.The dithizone twice extractionmethod was higher accuracy and precision，which can be utilized to determine the zinc concentration in walnut polypeptide oral emulsion.

walnutpolypeptide；emulsion；zinc；dithizone colorimetry

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.028

2016-08-12

湖北省大学生创新创业训练计划项目（No.201512310016，No.201512310017）

吴悠（1993—），女（汉），硕士研究生，研究方向：植物多肽糖尿病药物制剂研究。

*通信作者：刘阳，副教授，研究方向：天然药物药效物质基础研究。