3种食用菌分级多糖消脂护肝功能研究

赵爽，荣成博，刘宇，陈杰，徐甜甜

（1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京市食用菌工程技术研究中心，北京100097；2.农业部都市农业（北方）重点实验室，北京100097）

3种食用菌分级多糖消脂护肝功能研究

赵爽1，2，荣成博1，2，刘宇1，2，陈杰1，徐甜甜1

（1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京市食用菌工程技术研究中心，北京100097；2.农业部都市农业（北方）重点实验室，北京100097）

通过热水提取、乙醇沉淀的方式获得榆黄菇、毛木耳和灰树花多糖，利用分子量截留的超滤方法获得15个分级多糖组分。采用酒精和脂肪酸（FFA）共同诱导HepG2细胞建立脂肪肝模型，以细胞存活率和胞内甘油三酯含量为检测指标评价分级多糖消脂护肝作用。研究结果发现PSV、APV和GFV3个分子量高于100kDa的组分是各自品种分级多糖中的优势组分，比例分别为71.06%、34%和68.89%；3种分级多糖可以提高肝损伤细胞的存活率分别为27.61%、37.68%和29.25%，同时减少甘油三酯在细胞内的堆积，具有明显的消脂护肝作用。

榆黄菇；毛木耳；灰树花；多糖；消脂；护肝

脂肪肝是一种以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮存为特征的代谢性临床病理综合症，其特征是弥漫性肝细胞大疱性脂肪变性，是与高胰岛素血症、血脂异常、II型糖尿病以及遗传—环境—代谢应激密切相关的临床综合征[1-2]。随着生活水平的提高，脂肪肝的发病率不断增高，根据全球流行病学调查结果显示，脂肪肝在成年人中的发病率高达20%～33%，而肥胖人群中的发病率达到75%。脂肪肝包括单纯性肝脏脂肪变、脂肪性肝炎、脂肪性纤维化这一系列病变，最终可发展为肝细胞癌，脂肪肝病症已经引发社会的广泛关注[3-4]。目前临床上对于脂肪肝的治疗常采用降血脂药物、胰岛素增敏剂和抗氧化细胞保护药物为主，如他汀、二甲双胍和罗格列酮等[5]，同时辅以饮食及生活习惯调整的方法。中医多以疏利肝胆、健脾化湿、祛痰散结为主，复配抗脂肪肝的中草药来治疗脂肪肝[6]。

榆黄菇、毛木耳和灰树花是近年来北方地区广泛栽培具有药理活性的大型真菌。药理研究显示，灰树花、毛木耳多糖能够明显降低高脂血症大鼠血清中胆固醇和甘油三酯的含量，具有清除自由基和抗脂质过氧化的作用[7-10]。路玉兰等研究发现榆黄菇多糖能够增加小鼠脾脏重量，具有免疫调节的功能，何英还发现榆黄菇具有明显的保肝作用[11-12]。3种多糖具有调节免疫、降血脂和抗氧化的功效，具有治疗脂肪肝的应用潜力，但是在消脂护肝方面的研究却鲜见报道。因此本文针对3种多糖的消脂护肝功能展开了研究。

脂肪肝早期阶段是肝脂肪变，其特征表现就是甘油三酯形成脂滴沉积在肝细胞胞浆中，因此利用游离脂肪酸（FFA）诱导肝细胞脂肪变是目前常用的体外建模方式[13]。但是人体内脂肪肝形成往往是酒精和脂肪双重影响导致，本研究模拟体内环境采用酒精和FFA共同诱导，使细胞形成脂肪变模型，以细胞存活率和甘油三酯水平为评价指标，研究榆黄菇、毛木耳和灰树花15种分级多糖对HepG2细胞内脂肪堆积的缓解作用，以期望为护肝药物及功能食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

细胞株HepG2：中国医学科学院肿瘤医院；毛木耳3号、榆黄菇、灰树花菌株：北京市农林科学院植保所食用菌研究室保藏菌株；DMEM培养液、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素和链霉素）、胰酶：美国Invitrogen公司；油酸、棕榈酸、MTT测试液、二甲基亚砜（DMSO）、油红O：美国sigma公司；台盼蓝染液、Marry氏苏木素、无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司；甘油三酯（TG）酶法测定试剂盒：南京建成科技有限公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒：北京博迈德生物技术有限公司。

MSC-1.2生物安全柜、Steti-cycle371CO2培养箱：美国Thermo公司；分级超滤系统：美国Millipore公司；HYC-360药品保存箱：中国Haier公司；SHZ-88A恒温水浴锅：北京精科华瑞仪器有限公司；5810R冷冻离心机：美国Eppendrof公司；IX-71倒置显微镜：日本Olympus公司；移液器：美国Drummond公司。

1.2 方法

1.2.1 子实体分级多糖提取物的制备

将干燥的子实体制备成均一粉末，每一种子实体取20 g干粉，按1∶40（质量比）比例加入去离子水，然后在4℃的冰箱放置10 h，充分浸提后以水浴摇床控制温度和转速进行150 r/min、90℃、4 h的高温提取。水浴提取后，混合物以6 000 r/min离心30 min取上清，根据上清液体积，加入4倍体积的无水乙醇静置过夜使多糖析出，6 000 r/min离心30 min收集沉淀获得固体多糖，放至60℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状配置成溶液[10]。用Seveage法去除多糖溶液中的蛋白质，离心至无蛋白质层出现，合并上清液后加入无水乙醇获得多糖沉淀，烘干再溶解。将多糖溶液分别经过分子量截留为8、30、50、100 kDa的膜包进行超滤分离，获得5个分子量分级组分I、II、III、IV和V，即小于8 kDa、8 kDa～30 kDa、30 kDa～50 kDa、50 kDa～100 kDa和大于100 kDa组分，并以硫酸苯酚法确定每一种多糖组分的浓度[14]。

1.2.2 双因素脂肪损伤模型的建立

HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液（含1%青霉素、链霉素混合液）置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至80%～90%密度时用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度后接种于培养板进行试验。

取对数生长期的HepG2细胞，细胞以8×103个/孔的浓度接种于96孔培养板中，置于37℃培养箱中培养至细胞贴壁后，模拟体内脂肪肝形成机制，以乙醇和游离脂肪酸（FFA）双重因素诱导建模，检测乙醇和FFA对细胞存活率的影响，筛选复配浓度，使培养液中乙醇终浓度达到1.4%、1.6%和1.8%，FFA终浓度为0.25、0.5、0.75 mmol/L，设置对照组，继续培养24 h。小心去除96孔中的培养液，每孔加入20 μL 5 mg/mLMTT培养液，180 μL无血清RPMI 1640培养基。37℃继续培养，4 h后终止培养，吸弃孔内的上清液，每孔加入200 μL DMSO，振荡5 min使紫色结晶物充分溶解。在酶标仪上560 nm波长处测定各孔的OD值。以未加入乙醇和FFA的空白组作为对照，计算细胞的存活率，筛选细胞存活率在60%～70%之间的组别作为建模处理条件。

国家药品审评中心于2003年提出了 “仿产品不是仿标准”的指导思想[8]。本研究结果亦表明，质量标准对于不同来源产品的区分力是很弱的，难以揭示产品的内涵。出于产品放行和生命周期的考虑，质量标准的限度往往比较宽松，一个符合质量标准的产品是否一定是安全、有效的，还有待商榷。因此，一致性评价绝不能仅从质量标准一致着手。

细胞以1.5×104个/孔的浓度接种于含有细胞爬片的24孔培养板中，以1.8%的酒精和0.5 mmol/L FFA处理细胞24 h。建模结束后，用10%的甲醛固定细胞，以油红O稀释液染色15 min，洗涤细胞，用Marry氏苏木素浸染细胞核30 s，充分洗涤细胞，光镜下观察。

1.2.3 粗多糖细胞毒性评价

细胞以8×103个/孔的浓度接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，加入含有粗多糖的培养液，使多糖作用终浓度达到100、200、500、800、1 000 μg/mL，以未加多糖的处理组为对照，培养72 h后，用MTT比色法测定细胞存活率，设定对照组细胞活性为100%。

1.2.4 分级多糖消脂护肝功能检测

护肝功能检测：细胞以8×103个/孔的浓度接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后，加入酒精和FFA建立脂肪肝模型24 h，其后更换含有分级多糖的培养液处理模型组，以硫酸－苯酚法确定分级多糖各组分的多糖浓度，调节浓度使作用浓度均为50 μg/mL，与脂肪肝细胞共培养48 h。以未处理的细胞组为对照组，以酒精和FFA处理的细胞组为模型组，用MTT比色法测定细胞存活率，设定对照组细胞活性为100%。

消脂功能检测：细胞以3×105个/孔的浓度接种于6孔培养板中，选用最佳功效的分级多糖，设置终浓度为50 μg/mL处理模型组细胞，具体培养方法同护肝功能检测，共培养结束后弃去培养液，收集破碎细胞，用组织甘油三酯测定试剂盒测定TG含量，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，以μmol/mg protein表示。

1.2.5 数据统计分析

采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差（±s）表示，采用One－way ANOVA检验，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 榆黄菇、毛木耳和灰树花分级多糖的提取制备

表1 3种食用菌多糖产量及其提取率Table 1 Yields and extraction rates of the three edible fungus

3种粗多糖通过不同分子量截留分别获得5个组分，通过硫酸－苯酚法测定发现各组分多糖含量差异较大，表2显示的是3种粗多糖分级提取后各组分的分布情况。

表2 3种食用菌分级多糖含量分布Table 2 The contents of fractional polysaccharides of the three edible fungus

在榆黄菇多糖构成中，PS V组分所占比例最高，达到71.06%，其它4个组分含量相对平均，在3.78%～5.29%的范围内；灰树花分级多糖的分布与榆黄菇的相似，比例最大的组分是GF V，占到68.89%，其余组分分布范围从4.1%～5.24%；毛木耳多糖中AP III和AP V分布比例较大，分别为31.83%和34%，其次AP II分布比例为14.68%。通过分析发现，3种粗多糖中多糖分子量高于100 kDa的组分所占比例最高，相对分子量低的组分所占比例较少。

2.2 双因素脂肪损伤模型的建立条件

以前期酒精引发肝损伤的研究为基础[15]，选取引发低损伤的3个酒精浓度与FFA相互作用，图1显示的是双因素相互作用后对细胞存活率的影响。

图1 酒精和脂肪酸双因素对细胞存活率的影响Fig.1 Influences of ethanol and fatty acids on cells viability

结果显示酒精和FFA都可以降低HepG2细胞的存活率，是引发肝损伤的诱导因素。MTT结果显示，酒精浓度的为1.6%和1.8%的两个处理组中细胞存活率显著低于空白对照组（P＜0.05），在相同浓度酒精条件下，细胞存活率随着FFA的浓度升高而下降，通过分析发现酒精浓度为1.8%和0.5 mmol/LFFA共同作用的条件下，细胞存活率为68%，满足模型的需求。

油红O为活性很强的脂溶性染料，与组织或细胞的脂质有较强的亲和力，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色[16]，可以直观的显示出细胞中脂肪含量。依据细胞存活率的检测结果，选取酒精浓度1.8%和0.5 mmol/L的FFA共同作用建模，图2显示的是光镜下模型组与对照组细胞中油脂的含量。镜下观察显示，对照组的细胞内仅有少量红色油滴，而模型组细胞中密集的分布着红色油脂，说明通过酒精和FFA诱导能够引发脂肪肝的形成，可用于后续的功能研究。

图2 细胞内脂质油红O染色结果Fig.2 Intracellularlipid droplets staining with Oil red O

2.3 粗多糖的细胞毒性检测

3种粗多糖以多种浓度直接作用于细胞72 h后，通过MTT方法检测细胞的存活率发现经过榆黄菇多糖的处理，细胞存活率可以保持在94%以上，其中200 μg/mL～1 000 μg/mL能够促进细胞增殖，存活率超过100%（见图3）；毛木耳和灰树花粗多糖对HepG2不存在细胞毒性，各作用浓度均可使细胞的存活率保持在90%以上。检测结果证明3种多糖均可作为护肝药物开展护肝功能检测。

图3 3种粗多糖对HepG2细胞毒性检测Fig.3 Cytotoxicity assays of the three crude polysaccharides

2.4 分级多糖消脂护肝功能研究

3种食用菌的分级多糖以同一作用浓度处理脂肪肝细胞后，经过MTT检测细胞存活率发现各分级多糖组分都可以不同程度的提高细胞存活率。与模型组相比较，榆黄菇品种中PS IV和PS V组分是5个分级多糖中功效最显著的组分，两者的功效不存在显著差异（P＞0.05），分别可以提高细胞存活率达到28.79%和27.61%；毛木耳AP V组分活性最高，可提高存活率达到37.68%；灰树花GF V组分活性最高，可提高存活率达到29.25%，具体各组分对细胞存活率的影响见表3所示。

表3 分级多糖对肝损伤细胞存活率的影响Table 3 Influences of fractional polysaccharides on injury cells viability

经过分级多糖对细胞存活率作用的筛选，发现PS IV、PS V、AP V和GF V是3种食用菌的最佳功效组分。以上述分级多糖分别作用模型细胞48 h后，测定胞内TG含量来反映多糖的消脂作用。由图4显示PS IV、PS V、AP V和GF V可以分别降低细胞内TG含量达到55.43%、47.34%、54.68%和29.32%，与模型组比较均达到显著性差异的程度（P＜0.05），说明这4种多糖可以减少脂肪在细胞内的堆积。

综合多糖含量和功效分析发现，PS IV和PS V分别占榆黄菇子实体干重的4.35‰和81.72‰，AP V在毛木耳子实体干重中的含量为5.1‰，GF V占灰树花子实体干重的24.11‰。PS IV虽然是榆黄菇中护肝消脂功效最强的组分，但是其含量远低于PS V，因此PS V更适合作为功效组分进行开发应用。通过本研究的评价和筛选证明，PS V、AP V和GF V是榆黄菇、毛木耳和灰树花中的护肝降脂的功效成分，具有药物开发和应用的前景。

图4 分级多糖对胞内TG含量影响Fig.4 Influences of fractional polysaccharides on intracellular TG content

3 结论

本研究模拟体内脂肪肝成因在体外建立起酒精和脂肪酸双因素诱导的脂肪肝模型，在模型的基础上研究了榆黄菇、毛木耳和灰树花分级多糖对细胞存活率以及胞内甘油三酯含量的影响。结合分级多糖的提取率和功效分析筛选出PS V、AP V和GF V 3种护肝消脂功能多糖，为护肝药物的开发奠定了研究基础，扩大了食用菌多糖的应用范围。

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Reduce Fat and Hepato-protective Studies on Fractional Polysaccharides of Pleurotus citrinipileatus，Auricularia polytricha and Grifola frondosa

ZHAO Shuang1，2，RONG Cheng-bo1，2，LIU Yu1，2，CHEN Jie1，XU Tian-tian1
（1.Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom，Beijing 100097，China；2.Key Laboratory of Urban Agriculture（North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

This study obtained crude polysaccharides of Pleurotus citrinipileatus，Auricularia polytricha and Grifola frondosabythe hot-water-extraction and ethanol-precipitation method.The crude polysaccharides were divided into 15 fractional components using ultrafiltration method of molecular weight.Fatty liver injury model was induced by alcohol and fatty acids with HepG2 cells.The cell survival rate and intracellular triglyceride levels were detected to evaluate the hepato-protective effect of fractional polysaccharides.The results showed that the components PS V，AP V and GF V，molecular weight above 100 kDa，were the highest content fractions each strains with the ratios of 71.06%，34%and 68.89%，respectively.PS V，AP V and GF V could increase the survival rate of injury hepatic cells，which were 27.61%，37.68%and 29.25%，respectively.Meanwhile these fractional polysaccharides also reduced intracellular triglycerides accumulation，which indicated that they were potential agents in hepatic protection application.

Pleurotus citrinipileatus；Auricularia polytricha；Grifola frondosa；polysaccharide；reduce fat；hepato-protection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.037

2017-01-11

北京市优秀人才培养资助项目（2015000020060G138）；北京市农林科学院青年基金项目(QNJJ201524)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX20170205）

赵爽（1982—），女（回），助理研究员，博士，研究方向：食用菌功能及加工技术研究。