响应面法优化马齿苋多糖醇沉工艺

许海燕，徐江，王慧超，丁霞

（陕西国际商贸学院医药学院，陕西咸阳712046）

响应面法优化马齿苋多糖醇沉工艺

许海燕，徐江，王慧超，丁霞

（陕西国际商贸学院医药学院，陕西咸阳712046）

利用单因素试验结合响应曲面法（RSM）优化马齿苋多糖的醇沉工艺。在单因素基础上选取试验因素水平，根据中心组合设计原理采用三因素三水平的响应面分析法进行最佳工艺的优化，研究醇沉比、离心时间、离心转速比对马齿苋多糖提取率的影响。在分析各个因素的显著性和交互作用后，得到马齿苋多糖最佳醇沉工艺为在醇沉比为1∶4（mL/mL），离心时间为10min，离心转速为3800r/min时，提取率为9.5%。

马齿苋；多糖；醇沉工艺；响应面法

马齿苋是一种生活中随处可见的药食两用植物，中国的大部分区域都有生长。性喜肥沃的土壤，耐干又耐湿，极易存活。作为药物，其具有清热解毒、杀菌消肿的作用，被誉为植物中的抗生素，现代临床上常用其治疗痢疾、肠炎、肾炎、高血压等疾病[1]；多糖作为马齿苋药材当中一种很重要的活性成分，有抗癌、抗氧化和降糖的生物活性作用[2]。而马齿苋又被国家卫生部认定为药食两用的药材，在民间及临床当中应用非常广泛。

响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种寻找多种因素系统中最佳条件的数理统计方法[3]。可以依靠少量的试验数据来回归拟合各个因素与最终数据间的整体线性关系，以此来确保整体试验成果科学可信。响应曲面法具有高效、直观、方便等特点，结合了数学、统计学、计算机科学，用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，是目前用于工艺条件优化的有效方法[4]。

本文采用响应曲面法优化马齿苋多糖的醇沉工艺，用单因素试验挑选出最优单因素方案，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取醇沉比、离心时间、离心转速三因素进行响应曲面分析，得到最佳的醇沉工艺优化方案。

1 材料与仪器

1.1 原料

马齿苋：购于咸阳百姓乐药房，经过陕西国际商贸学院生药教研室雷国莲教授的鉴定，确定为马齿苋正品。

1.2 试剂

标准品为D-无水葡萄糖（批号150833-201604）：上海源叶生物科技有限公司；石油醚、乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸：均为分析纯，天津市河东区红岩试剂厂；水为超纯水。

1.3 仪器

TU-1810紫外可见分光光度计：北京普希仪器有限责任公司；循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限公司；TDL-60B离心机：Anke；KH5200DE型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限责任公司；FW-100D高速万能粉碎机：天津鑫博得仪器有限责任公司；TE124S分析天平（万分之一，sartorius）、CP225D电子分析天平（十万分之一，sartoeius）、RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DHG-9240A干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.4 马齿苋的处理

将马齿苋原材料清洗干净，干燥后粉碎。取马齿苋粉末加入石油醚置索氏提取器中对马齿苋粉末进行回流脱脂。

将脱脂处理后的粉末，加10倍量水，于超声提取器中在50 kHz下用温度75℃，时间60 min进行提取。提取完成后，提取液依次进行过滤、浓缩至适当体积，然后在浓缩液中加入不同倍体积的无水乙醇确定最佳醇沉比；在最佳醇沉比下用不同的离心时间和离心转速进行离心，确定最佳离心时间与离心转速。最后将处理所得沉淀用80%乙醇、丙酮洗涤，减压干燥后，得马齿苋粗多糖。

1.5 标准曲线制备[5]

精密称量20 mg在105℃干燥至恒定重的葡萄糖标准品，于100 mL的容量瓶中溶解定容至刻度，制成葡萄糖标准溶液，再精密量取5份1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的标准溶液，将其分别置于10 mL的容量瓶内定容。5份定容后试液各取1 mL加入10 mL具塞试管内，再加入1.0 mL的6%苯酚溶液，摇匀后迅速加入5 mL的浓硫酸，将其混合均匀，冷却。置水浴锅中沸水浴20 min，冷却至室温。另取纯水1 mL按照同样的方法加入试剂，得到空白对照液，在490 nm处测吸光度。具体结果见表1。

以吸光度A为纵坐标，葡糖糖的浓度为横坐标，绘标准曲线见图1。

表1 葡萄糖标准溶液与浓度的关系Table 1 The glucose standard solution with concentration of relationship

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

其回归方程y=1.485 0x+0.013 1，相关系数R2= 0.998 9。

1.6 马齿苋多糖提取率的计算

对马齿苋粗多糖进行精密称取，称取0.010 g置100 mL容量瓶内溶解，定容至刻度。取此定容后的溶液作为供试品溶液，精密吸取1 mL，再按苯酚-硫酸法处理后，用分光光度法测定吸光度，计算出马齿苋多糖的提取率。

多糖提取率/%=马齿苋多糖质量（g）/马齿苋样品质量（g）×100

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验考查

根据单因素试验结合响应面法，以马齿苋多糖提取率（%）为指标，以醇沉比（A，mL/mL）、离心时间（B，min）、离心转速（C，r/min）为三个单因素，设计三因素三水平的Box-Behnken试验，确定17组试验，试验因素水平见表2。

表2 试验因素水平表Table 2 Factors and level coding of test

2.1.1 醇沉比对提取率的影响

称取5份已脱脂的质量相同的马齿苋粗粉按照1.4项下要求进行处理，提取液浓缩至10 mL。选取醇沉比[浓缩液：无水乙醇，（mL/mL）]分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，五个水平，分别加入预定条件倍数的无水乙醇，放置过夜后。在离心机中用转速为3 000 r/min，离心时间为10 min，沉淀用80%乙醇、丙酮洗涤，减压干燥后，得马齿苋粗多糖，称重，计算多糖的提取率。

醇沉比对多糖提取率的影响如图2所示。

图2 醇沉比对马齿苋多糖提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-alcohol ratio on the extraction of the polysaccharides yield

马齿苋多糖的提取率随着醇沉比的增加也有所增加，但到达1∶4（mL/mL）后再增加醇沉比，提取率不增反降。可能是因为1∶4（mL/mL）后一些杂质也沉降下来，对多糖测定有影响，使得多糖提取率不增反降，所以确定最佳醇沉比为1∶4（mL/mL）。

2.1.2 离心时间对多糖提取率的影响

称取5份质量相同的已脱脂的马齿苋粗粉按照1.4项下进行提取处理，浓缩液加4倍体积无水乙醇，在离心机中用转速为3 000 r/min，时间分别为2、4、6、8、10 min离心，沉淀分别用80%乙醇、丙酮洗涤，减压干燥后，得马齿苋粗多糖，称重，计算多糖的提取率。

图3 离心时间对马齿苋多糖提取率的影响Fig.3 Effect of centrifugal time on the extraction of the polysaccharides yield

如图3所示，随着离心时间的增加，马齿苋多糖的提取率也有所增加，但在8 min时达到最大，随后增加离心时间多糖提取率变化不大。这可能是因为8 min时多糖已基本沉降完全，再增加离心时间已无意义。所以确定最佳离心时间为8 min。

2.1.3 离心转速对提取率的影响

称取5份质量相同的马齿苋脱脂粗粉按照1.4项下进行提取处理，浓缩液加4倍体积无水乙醇，离心时间确定为8min，在1000、2000、3000、4 000、5 000 r/min转速下离心沉淀，离心后沉淀分别用80%乙醇、丙酮洗涤，减压干燥后，得马齿苋粗多糖，称重，计算出多糖的提取率。

离心转速对多糖提取率的影响如图4所示。

图4 离心转速对马齿苋多糖提取率的影响Fig.4 Effect of the centrifugal rotational speed on the extraction of the polysaccharides yield

从图4中可以直观看出，随着离心转速的增加，马齿苋多糖的提取率也逐渐增加，在4 000 r/min时达到最大，再增加转速，提取率反而有所降低。这可能是因为随着转速的增加，沉降的杂质颗粒有所增加，以至于对多糖的测定有所影响，故提取率下降，所以离心转速选择4 000 r/min为最佳。

2.2 响应曲面试验结果及分析

2.2.1 响应曲面试验结果

根据单因素试验，采用响应曲面法Box-Benhnken（BBD）设计试验优化方案，以多糖提取率为响应值，使用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行数据分析。该响应曲面设计的试验条件和试验结果见表3。其中A，B，C分别为离心时间、离心转速与醇沉比三因素。

表3 响应面分析试验设计Table 3 Experimental design of response surface methodology

续表3 响应面分析试验设计Continue table 3 Experimental design of response surface methodology

2.2.2 回归模型方程的建立及方差分析

根据响应曲面法Box－Benhnken对马齿苋多糖的醇沉工艺进行优化，结果共设计出17组试验点进行试验。试验结果使用Design－Expert 8.0.6 Trial软件进行数据分析，得到多元二次回归模型方程式：

其中：Y为马齿苋多糖提取率；A、B、C分别为3因素的编码值。

回归方差分析见表4，从回归方程方差分析表中可看出，P模型＜0.000 1，F模型=1 646.43＞0.05，表明了本次研究选用的二次回归方程模型非常显著。马齿苋多糖提取率F失拟=0.14＞0.05，P失拟=0.929 2＞0.05，表示失拟不显著。综上所述，该模型能够很好表示出自变量和响应值之间的关系。表中调整确定系数R2Adj=0.998 9，说明99.89%响应值的变化可以用这个模型解释，仅有约0.11%的响应值不能用此模型进行解释[6]。此外，从表4可以明显看出，醇沉比、离心时间、离心转速都对马齿苋多糖的提取率产生显著的影响，AB、BC交互项影响显著，说明醇沉比和离心时间及离心时间与离心转速之间具有显著影响。AC交互项影响不显著，说明醇沉比与离心转速之间影响不显著。各二次项的影响都比较明显。由此可以发现多糖提取率和各因素之间不是单纯的线性关系。由P值的大小可以得出各因素对于马齿苋多糖的提取率影响顺序为：A（醇沉比）＞B（离心时间）＞C（离心转速）。

表4 回归方程方差分析表Table 4 Regression equation analysis of variance table

使用Design－Expert 8.0.6 Trial软件绘制而成的响应曲面图如图5～图7所示。

图6 醇沉比和离心转速对马齿苋多糖提取率的响应面图与等高线图Fig.6 Liquid-to-alcohol ratio and centrifugal rotational speed response surface and contour plot

图7 离心时间和离心转速对马齿苋多糖提取率的响应面图与等高线图Fig.7 The centrifugal time and centrifugal rotational speed response surface and contour plot

图8 标准残差图Fig.8 Standard residual figure

从这些响应曲面图上可以看出3因素的最佳参数和各因素之间的交互作用。图5可以反应出醇沉比和离心时间这两个因素对马齿苋多糖提取率的影响，从此图得出最佳醇沉比范围为1∶3（mL/mL）～1∶5（mL/mL），最佳离心时间范围为8 min～10 min。图6可以确定醇沉比和离心转速这两因素对马齿苋多糖提取率的影响，从此图可看出最佳醇沉比范围为1∶3（mL/mL）～1∶5（mL/mL），最佳离心转速范围为3 500～4500。图7可以确定离心时间和离心转速这两因素对马齿苋多糖提取率的影响，从图可以看出离心时间最佳范围为8 min～ 10 min，离心转速最佳范围为3 500～4 500。图8为标准残差图，从此图可以发现模型值与试验值拟合度很高，说明此模型可以用来解释各因素和响应值的关系，可以用此方法对马齿苋多糖的提取工艺进行优化。

根据Design-Expert 8.0.6 Trial软件对模型方程计算整理。可以得出马齿苋多糖的最佳提取工艺为：醇沉比为1∶4.42（mL/mL），离心时间为10 min，离心转速为3 873.49 r/min。在此工艺条件下马齿苋多糖的提取率可以达到9.6%。但是为了在实际生产操作中更为方便快捷，所以将模型所给最佳工艺参数修正为：醇沉比为1∶4（mL/mL），离心时间为10 min，离心转速为3 800 r/min，在此工艺条件下重复平行试验的实际平均提取率为9.5%，相比模型的提取率只降低了约0.1%左右。

3 结果与讨论

目前，中药材的提取工艺优化多为均匀设计和正交设计，此类方法不能考察因素之间的相互作用，同时也很难考察多个响应值与因素之间的交互作用关系[7]。响应面分析法（response surface methodology，RSM）是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法.通过局部试验回归拟合因素与结果间的全局函数关系，从而得到准确有效的试验结论，能全面考察各个因素的最佳组合及最优响应值，研究几种因素间的交互作用[8-10]。

本文以马齿苋多糖的提取率为考查指标，来优化马齿苋多糖的醇沉工艺，通过对醇沉比、离心时间、离心转速三因素的多元回归和二项拟合建立回归方程，得到以马齿苋多糖提取率为响应面值的响应曲面图，再通过对试验结果的分析，确定了马齿苋多糖的最佳醇沉工艺参数。本试验为马齿苋多糖的醇沉工艺提供了很好的参数，也为其它植物多糖的提取提供了良好的试验依据。

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Optimization of Polysaccharides Technology of Ethanol Precipitation from Portulace oleracea L.by Response Surface Methodology

XU Hai-yan，XU Jiang，WANG Hui-chao，DING Xia
（Medical College，Shaanxi Institute of International Trade，Xianyang 712046，Shaanxi，China）

Response surface methodology（RSM）was used to optimization of ethanol precipitation of polysaccharides from Portulace oleracea L..Based on the single factor analysis，the effect of centrifugal time，the centrifugal rotational speed and solid-to-alcohol ratio on polysaccharides from Portulace oleracea L.was evaluated by response surface analysis.Three factors，three levels central composite experimental design was applied and the interactions of each factor on the polysaccharides from Portulace oleracea L.were also investigated.The centrifugal rotational speed and solid-to-alcohol ratio had significant effects on extraction yield.The optimal conditions of polysaccharides in Portulace oleracea L.alcohol sinking process were as follows：the liquid-to-alcohol ratio was 1∶4（mL/mL），centrifugal time was 10 min，and the centrifugal rotational speed was 3 800 r/min. Under such conditions，extraction of the polysaccharides yield was 9.5%.

Portulace oleracea L.；polysaccharides；technology of ethanol precipitation；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.014

2016-08-01

国家级大学生创新创业训练计划项目（201513123820）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（2509）

许海燕（1977—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：中药化学成分提取与分离研究。