单味及多味中药灌洗对豚鼠鼻咽癌放疗后鼻腔黏膜的影响*

邓 鹏

广西壮族自治区南溪山医院耳鼻咽喉科(桂林 541000)

单味及多味中药灌洗对豚鼠鼻咽癌放疗后鼻腔黏膜的影响*

邓 鹏

广西壮族自治区南溪山医院耳鼻咽喉科(桂林 541000)

目的: 探究单味及多味中药灌洗对鼻咽癌放疗后鼻腔、鼻咽组织的修复作用。方法：将80只豚鼠分为单纯照射组、对照组、鼻腔单味中药(铁皮石斛)灌洗组、多味中药中药灌洗组，每组20只。每组豚鼠用Co-60治疗机产生的射线作鼻部照射，照射开始当天即开始给药，对照组用生理盐水鼻腔；鼻腔单味中药灌洗组用新鲜铁皮石斛提取后的灌洗液灌洗；多味中药灌洗组用中药复方制剂吸入液对豚鼠鼻腔灌洗；对照组及单纯照射组不用药。采集总动脉处血液行肝肾功能检测，取鼻咽部黏膜HE染色后行光学显微镜观察细胞形态，原位免疫组织化学法(TUNEL法)检测药物对黏膜组织内细胞凋亡的影响，透射电镜及扫描电镜观察超微结构变化。结果：肝肾功能检测发现各组及多味中药灌洗组ALT、AST、AST/ALT、BUN、Cr水平有统计学差异(P<0.05)；HE染色发现除对照组外，其余三组均呈不同程度的炎症状态；各TUNEL法发现各组均出现TUNEL阳性细胞，其中多味中药灌洗组TUNEL阳性细胞数最少，其次为单味中药灌洗组，对照组最多。电镜检查发现单味及多味中药灌洗组的纤毛倒伏、线粒体破坏等较对照组明显减少。 结论：单味及多味中药灌洗法对于鼻咽癌放疗后损伤的鼻黏膜修复作用更加明显，能够促进炎症的消退，抑制细菌的生长。

鼻咽癌放疗常伴鼻咽部、鼻腔及鼻窦等正常组织的不同程度的损伤，导致放疗后鼻窦炎、放射性咽炎的发生，常伴有鼻咽顶部黏膜缺损、痂皮堆积[1-2]。单纯用生理盐水冲洗冲洗不能达到很好的效果，用抗生素长期冲洗常导致耐药而失效。用多味中药灌洗治疗放射性咽炎、用中药行鼻腔灌洗等能有效促进正常组织的修复，促进炎症的消退，抑制细菌的生长等[3]。因此本研究探究多味中药灌洗及单味中药灌洗法给药对鼻咽癌放疗后鼻腔、鼻咽组织的修复作用，为临床医生选择给药途径提供理论依据。

材料与方法

1 实验动物模型建立 选取80只豚鼠，使用二亚硝基哌嗪(DNP)皮下注射，诱导鼻咽部上皮癌变。剂量为40mg/kg，每周两次皮下注射，共注射6周。

2 治疗方法 将80只豚鼠分为对照组、单纯照射组、单味中药灌洗组、多味中药灌洗组，每组20只。各组豚鼠无麻醉下固定器固定,用Co-60治疗机产生的射线作鼻部照射，照射剂量30Gy，每次300cGy，每周5次，共照射10次(2周)。照射开始当天即开始给药，单味中药灌洗组用在桂林医学院药学院熬煎及分离提纯的新鲜铁皮石斛对豚鼠鼻腔每天灌洗1次，共灌洗4周；多味味中药灌洗组用在桂林医学院药学院熬煎及分离提纯的中药灌洗液(苍术、辛夷花、五味子、白芷、薄荷、黄岑、金银花、连翘)对豚鼠鼻腔每天灌洗1次，共灌洗4周；多味中药灌洗组用瑞康医院药厂配制的多味中药灌洗液(生理盐水、鱼腥草注射液、地塞米松)对豚鼠雾化吸入，每天1次，共雾化吸入4周；对照组用生理盐水灌洗。

3 标本采集及处理

3.1 标本采集：按照射后第1天、2周、4周、8周、12周的时间顺序每次每组随机选择4只豚鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后采集颈总动脉处血液行肝肾功能检测，随即断头，分别取中鼻甲黏膜、下鼻甲黏膜、鼻咽部黏膜、口咽部黏膜HE染色后行光学显微镜观察细胞形态，原位免疫组织化学法(TUNEL法)检测药物对黏膜组织内细胞凋亡的影响。扫描机透射电镜检查超微结构。

3.2 肝肾功能检测：采集颈总动脉处血液行肝肾功能检测，检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)水平。

3.3 HE染色：取豚鼠鼻咽部黏膜用10%福尔马林固定后，常规包埋、切片。①HE染色前将标本脱蜡入水，先浸入二甲苯20 min，然后浸入酒精从100%到70%梯度入水，每个梯度浸泡3 min。②苏木素浸染5 min，冲水。③浸入分化液(1%盐酸酒精)中，分化30s，使切片褪色至淡红色，冲水5 min使之呈蓝色。④伊红浸染3 min，冲水。⑤酒精梯度脱水后，二甲苯透明，树胶封片。

3.4 TUNEL染色：①TUNEL染色前将标本脱蜡入水，先浸入二甲苯20 min，然后浸入酒精从100%到70%梯度入水，每个梯度浸泡3 min。②使用20μg/ml蛋白酶K进行抗原修复，室温15 min，PBS洗三次，每次5min。③使用3%过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶，37℃室温10 min。④使用ApoTag试剂盒进行TUNEL染色：滴加30U/ml TdT进行DNA片段标记，37℃孵育60 min；滴加HRP连结的抗荧光素抗体，室温孵育30min；DAB显色，在细胞核呈现棕黄色时立即使用自来水终止反应，苏木素复染。⑤酒精梯度脱水后，二甲苯透明，树胶封片。统计显微镜下每个视野中TUNEL阳性细胞数百分比。

3.5 电镜检查：扫描电镜及透射电镜标本制作及观察：标本依次经过2.5%戊二醛固定12 h以上，逐级漂洗、脱水、固定，扫描电镜及透射电镜观察。

4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件，肝肾功能指标数值、TUNEL阳性细胞数百分比采用均数±标准差表示，使用t检验，以P<0.05为具有统计学差异。

结 果

1 各组肝肾功能指标比较 采集颈动脉血液进行肝肾功能检测分析发现，对照组、单纯照射组、单味中药灌洗组及多味中药灌洗组ALT、AST、AST/ALT、BUN、Cr水平无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组肝肾功能指标比较

2 HE染色 对照组、单纯照射组、单味中药灌洗组及多味中药灌洗组进行HE染色后光镜下观察发现，单纯照射组、单味中药灌洗组及多味中药灌洗组均呈不同程度的炎症状态，以单纯照射组炎症最为显著，HE染色显示炎症细胞数目最多，而单味中药灌洗组及多味中药灌洗组炎症状态较单纯照射组明显减轻，多味中药灌洗组减轻更为明显。组织形态学染色说明中药雾化治疗能够明显减轻鼻黏膜炎症状态，见图1。

3 TUNEL染色 通过收集第1天、2周、4周、8周、12周鼻咽部黏膜组织，采用TUNEL法检测药物对黏膜组织内细胞凋亡的影响，除对照组不接受放疗外，发现单纯照射组、单味中药灌洗组及多味中药灌洗组均出现TUNEL阳性细胞，其中对照组TUNEL阳性细胞数最多，其次为单味中药灌洗组，说明多味中药灌洗或单味中药灌洗对鼻咽癌放疗后鼻黏膜损伤有修复作用，而多味中药灌洗组修复疗效最为显著，见图2。

通过分析第1天、2周、4周、8周、12周TUNEL阳性细胞数百分比发现，第一天时，因未接受长时间放射治疗，对照组、单纯照射组、单味中药灌洗组、多味中药灌洗组TUNEL阳性细胞百分比无明显差异(P>0.05)，而2周、4周、8周、12周单味中药灌洗组及多味中药灌洗组均较单纯对照组TUNEL阳性细胞数百分比低，且多味中药灌洗组更为显著(P<0.05)，在第2周时，各组TUNEL阳性细胞数百分比较高，说明放射治疗结束后，由于鼻黏膜损伤，TUNEL阳性细胞数百分比增加，但随着中药灌洗及多味中药灌洗治疗，TUNEL阳性细胞数百分比有所降低，见表2。通过TUNEL细胞凋亡检测发现多味中药灌洗法给药途径较鼻腔灌洗法对鼻咽癌后鼻黏膜损伤修复作用更好[3]。

图1 HE染色显示鼻黏膜炎症状态(2周) 图2 TUNEL染色显示鼻咽部凋亡细胞数目(2周)

组 别1d2周4周8周12周对照组4.21±0.334.43±0.833.77±0.644.18±0.734.01±0.38单纯照射组4.57±0.6683.88±5.6188.22±3.9382.24±6.7783.37±8.43单味中药灌洗组4.77±0.6577.24±3.66*△48.33±5.61*△40.69±7.33*△33.83±2.55*△多味中药灌洗组4.50±0.5769.27±4.86*△▲45.55±4.31*△▲39.43±3.76*△▲29.56±4.38*△▲

注：与对照组比较，*P<0.05；与单纯照射组比较，△P<0.05；与单味中药灌洗组比较，▲P<0.05

讨 论

鼻咽癌是广西高发的恶性肿瘤，放疗是治疗鼻咽癌的有效方法之一，但是鼻咽癌放疗后放射线对口、咽黏膜唾液腺损伤，使唾液分泌受阻，黏膜自洁能力下降，常易发生感染，同时放射线还能够损伤黏膜组织，损伤血管内皮细胞，造成血管痉挛、堵塞等，最终黏膜因血液供应不足出现黏膜溃疡、糜烂等。单纯用生理盐水冲洗冲洗不能达到很好的效果，用抗生素长期冲洗常导致耐药而失效[4]。而研究发现，利用中药抗菌消炎、消肿止痛、活血生肌等功效，能够促进鼻咽癌放疗后黏膜损伤的修复，恢复鼻腔生理功能[4]。同时随着中医中药的发展，中药剂型的种类也越来越多。

本研究通过用多味中药灌洗及单味中药灌洗法给药对鼻咽癌放疗后鼻腔、鼻咽组织的修复作用。采集颈动脉血液进行肝肾功能检测分析发现，对照组、单纯照射组、单味中药灌洗组及多味中药灌洗组ALT、AST、AST/ALT、BUN、Cr水平无统计学差异，说明无论何种治疗方式对于豚鼠肝肾功能无影响。

鼻咽癌放疗后鼻黏膜出现炎症细胞浸润，HE染色发现，除对照组外，其余三组均呈不同程度的炎症状态，以单纯照射组炎症最为显著，HE染色显示炎症细胞数目最多，而单味中药灌洗组及多味中药灌洗组炎症状态较单纯照射组明显减轻，多味中药灌洗组减轻更为明显，说明中药给药能够有效抑制鼻黏膜炎症状态[5]。

由于放疗后鼻黏膜出现溃疡、糜烂等，通过TUNEL细胞凋亡染色对受损鼻黏膜分析发现，除对照组不接受放疗外，单纯照射组、单味中药灌洗组及多味中药灌洗组均出现TUNEL阳性细胞，说明放疗能够造成鼻黏膜损伤等并发症，其中对照组TUNEL阳性细胞数最多，而多味中药灌洗组最少，说明多味中药灌洗或单味中药灌洗对鼻咽癌放疗后鼻黏膜损伤有修复作用，而多味中药灌洗组修复疗效最为显著[6]。通过定量分析发现，在第2周时，由于2周的放射治疗结束，鼻黏膜呈不同程度损伤，各组TUNEL阳性细胞数百分比较高，但随着中药灌洗及多味中药灌洗治疗，TUNEL阳性细胞数百分比有所降低。通过TUNEL染色对鼻黏膜组织观察发现，多味中药灌洗法给药途径较鼻腔灌洗法对鼻咽癌后鼻黏膜损伤修复作用更好[7]。

综上所述，多味中药灌洗法给药途径较鼻明显腔灌洗法治疗对于鼻咽癌放疗后损伤的鼻黏膜修复作用更加明显，能够促进炎症的消退，抑制细菌的生长。

[1] 景 艳,康 敏,刘 津,等. 白花蛇舌草多糖诱导鼻咽癌细胞凋亡及其机制研究[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,29(7):641-643.

[2] 李 艺，张 勉，叶辉信. 鼻窦炎合剂行鼻腔冲洗治疗鼻咽癌放疗后鼻窦炎的临床疗效[J]. 临床合理用药，2016，9(6)：109-110.

[3] 王锋钢,王永昶. 淋巴结转移对鼻咽癌预后的研究[J].陕西医学杂志，2016,45(4)：474-477.

[4] 王鹏飞，赵文飞，张春玲. 复方苦参注射液联合放化疗治疗局部晚期鼻咽癌疗效[J]. 齐齐哈尔医学院学报，2015，36 (9)：1277-1279.

[5] 林 毅，姚 俊. 黄酮类化合物抗鼻咽癌作用的研究进展[J]. 海南医学，2016，27(13)：2176-2178.

[6] 魏少贤. 中药复方苦参注射液联合放化疗治疗局部晚期鼻咽癌 的疗效观察[J]. 中西医结合心血管病杂志，2016，3(18)：87-88.

[7] 黄金圣,黄学武. 养阴清热法对鼻咽癌放疗后患者敏感性的影响[J].陕西中医，2015,36(9)：1195-1197.

(收稿：2016-10-23)

The effect of single or complex Chinese medical herbs’ lavage to nasal cavity and nasopharyngeal tissues after radio therapy to nasopharynx cancers

Deng Peng.

Department of Otolaryngology,Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region(Guilin 541002)

Objective: To explore the refin-effect of single or complex Chinese medical herbs’ lavage to nasal cavity and nasopharyngeal tissues after radio therapy to nasopharynx cancers.Methods: Eighty guinea pigs were divided into 4 groups including irradiated group, control group, treatment group with single Chinese medical herb and treatment group with complex Chinese medical herbs. The guinea pigs in each group irradiated with radiation therapy machine. Drugs were given the day when the irradiation was started. For the control group, irrigated the nasal cavity of guinea pigs with. For the treatment group with single Chinese medical herb, irrigate the nasal cavity of guinea pigs with extracting solution of dendrobium candidum. For the treatment group with complex Chinese medical herbs, irrigate the nasal cavity of guinea pigs with inhalation solution of complex Chinese patent medicine once a day for 4weeks.Collect the blood in common carotid artery irradiation, and tested the liver and kidney function. The nasopharyngeal mucosa was taken at the same time and was observed with HE staining and electron microscope, and detect the influence of drugs on cell apoptosis of mucosa tissue with TUNEL, and observed the change of ultrastructure by transmission electron microscopy or scanning electron microscope.Results: ALT、AST、AST/ALT、BUN and Cr were significantly different (P<0.05) in this four groups through the test of liver. Through the test of TUNEL, we found that all the groups had TUNEL-positive cells, and the treatment group with complex Chinese medical herbs got the least number of it, then the treatment group with single Chinese medical herb, and the control group got the largest number of it. The phenomena of cilia lodging and mitochondrial damage were significantly reduce compared with the control group by electron microscopy.Conclusion: The lavage method of single or complex Chinese medical herbs to nasal cavity and nasopharyngeal tissues after radio therapy to nasopharynx cancers was significantly effective. And it can promote the resolution of inflammation, and inhibit the growth of bacteria.

Nasopharyngeal neoplasms Animal experimentation Guinea pigs

*广西科学研究与技术开发计划项目(桂林攻13349008)

鼻咽肿瘤 动物实验 豚鼠

R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.060