出口普洱茶中大肠菌群的污染状况和潜在致病菌分析

陈 芸 杨玲春 陈丽萍 殷 红 朱红玉 范 焱 王裔耿 李云飞 王文珍

(云南出入境检验检疫局，昆明 650228)

出口普洱茶中大肠菌群的污染状况和潜在致病菌分析

陈 芸 杨玲春 陈丽萍 殷 红 朱红玉 范 焱 王裔耿 李云飞 王文珍

(云南出入境检验检疫局，昆明 650228)

本文拟分析云南口岸出口普洱茶中大肠菌群的污染状况，对检测过程中发现的细菌进行种属分布和致病性探讨，揭示导致出口普洱茶大肠菌群超标的微生物污染因子和出口普洱茶肠道致病菌的污染风险，为普洱茶的出口监管和生产过程控制提供一定的数据支持。根据国标方法进行出口普洱茶样品的大肠菌群检测，并使用全自动微生物质谱鉴定仪、生化鉴定仪和生化鉴定试剂条对分离出的革兰氏阴性细菌进行鉴定。结果显示，2015～2016年间共检测76份出口普洱茶样品，大肠菌群超标率为15.8%。出口普洱茶中大肠菌群的主要污染微生物为肠杆菌属和克雷伯菌属，导致大肠菌群指标超标的主要微生物为阴沟肠杆菌。检测过程中共分离出8个种属的细菌，其中包括绿脓杆菌等革兰氏阴性致病菌，说明出口普洱茶有潜在肠道致病菌污染的风险。

出口；普洱茶；大肠菌群；潜在；致病菌

云南是中国茶叶大省，每年有大量茶叶经由云南口岸出口至东南亚和欧洲。云南出口茶叶普洱茶是地理性标志产品，普洱茶是以大叶种晒靑毛茶为原料，经自燃发酵陈化或人工渥堆后发酵而制成的再加工茶类[1]。“渥堆”是一个多种微生物参与的固态发酵过程，是在湿热环境中，以晒青茶的内含化学成分作为基质，在微生物分泌的胞外酶作用下，发生的一系列生物转化过程[2]。普洱茶特殊的生产加工方式导致其所携带的微生物本底含量非常丰富，有些微生物对普洱茶色香味的形成有关键作用，而有些微生物则可能是生产加工流通过程中的污染菌。目前普洱茶检验的主要依据有 GB/T22111-2008《地理标志产品 普洱茶》,其中微生物检测指标中要求大肠菌群≤300 MPN/100 g。但是近年来出口普洱茶检测经常发现样品含有大肠菌群，其检出率和超标率都比较突出。

本文通过微生物质谱鉴定仪(MALDI-TOF)、自动生化鉴定仪和手工生化鉴定试剂，对出口普洱茶中大肠菌群的细菌进行了鉴定。基于蛋白质组学的微生物质谱检测技术具有高灵敏度、高通量和快速的特点[3]，结合全自动生化鉴定仪和手工生化试验进行细菌鉴定，更增加了细菌鉴定结果的准确度和可靠性。通过对分离鉴定情况进行统计，本文给出了导致出口普洱茶大肠菌群超标的污染细菌名单，并对检测过程中出现的革兰氏阴性细菌鉴定结果进行讨论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

出口普洱茶样品和出口企业委托报检样品，包括普洱茶生茶和熟茶，散茶与紧压茶。

生化试剂：乳糖胆盐发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基(EMB)、乳糖复发酵培养基、结晶紫中心红胆盐琼脂(VRBA)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)、煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)、血琼脂平板：广东环凯生物科技有限公司；API20E、GN 鉴定卡、CHCA、靶板：梅里埃诊断产品(上海)有限公司。

1.2 设备

生物显微镜：奥林巴斯(中 国)有限公司(OCN)；生化培养箱：东京理化；自动压力蒸汽灭菌器：雅玛拓，VITEK 2 compact 60 全自动微生物鉴定仪、VITEK MS 全自动快速微生物质谱检测系统：梅里埃诊断产品(上海)有限公司。

1.3 检验方法

按照 GB/T4789.3-2003《食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》、GB4789.3-2010《食品微生物学检验 大肠菌群计数》的检测方法进行检验。对结果超标的样品大肠菌群细菌使用 VRBA 进行划线分纯培养，挑选形态各异、数量具有代表性的菌株使用 API20E、VITEK 2 compact 鉴定系统和 VITEK MS 质谱鉴定仪进行细菌鉴定。

1.4 判定标准

依据 GB/T 22111-2008《地理标志产品 普洱茶》中大肠菌群的指标要求对样品进行符合性判断，检测结果≤300 MPN/100 g的样品视为大肠菌群合格，结果>300 MPN/100 g的样品视为大肠菌群不合格。

2 结果与分析

2.1 大肠菌群检测

对2015年和2016年云南出口的76份普洱茶样品进行大肠菌群测定，结果有48份样品未检出大肠菌群，另28份样品大肠菌群检出，其中12份大肠菌群数量呈超标状态，见表1。

表1 2015-2016年云南省出口普洱茶大肠菌群检测结果

结果显示，2015年云南口岸出口的普洱茶大肠菌群指标不合格率为19.0%,2016 年大肠菌群不合格率为11.8%，相比前一年大肠菌群的检出阳性率和不合格情况有改善趋势。

2.2 细菌的分类鉴定

从不合格的样品大肠菌群发酵菌液中分离革兰氏阴性细菌，在 VRBA 和 EMB 平板上进行分离划线和分纯培养，共获得190个菌株。这些菌株使用 VITEK 2 compact 全自动微生物鉴定仪、 VITEK MS 全自动快速微生物质谱鉴定仪和 API20E 手工进行鉴定，发现分为大肠菌群和非大肠菌群两类细菌。

检测到的大肠菌群细菌主要包括肠杆菌属、埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属和沙雷菌属。其他非大肠菌群的革兰氏阴性杆菌，经鉴定为勒克氏菌属、泛菌属和假单胞菌属。鉴定结果见表2、表3。

由表2、表3可知，肠杆菌属、埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和沙雷菌属皆属于肠杆菌科细菌，出口普洱茶中的大肠菌群以此5个属细菌数量最为庞大，共130 株，构成了出口普洱茶中大肠菌群细菌类群。其中大肠菌群阳性样本中最常分离到的细菌是阴沟肠杆菌，检出率达到64.3%。除大肠菌群以外，还检出60株非大肠菌群的革兰氏阴性细菌，这些细菌和大肠菌群细菌一起构成了出口普洱茶中革兰氏阴性细菌的主要类别。

表2 出口普洱茶中大肠菌群细菌的鉴定结果

表3 出口普洱茶大肠菌群检测中发现的非大肠菌群类细菌的鉴定结果

3 讨 论

云南茶产业在全国茶产业中位列种植面积第二、产量第二、综合产值第四的位置。云南省共有出口茶叶备案基地133块，占全省茶叶种植面积的 8%。2013至2015年云南省出口茶叶贸易量为1900多批次，贸易金额达到2亿多美元，其中普洱茶出口量占全省成品茶出口量的三分之一，为特色优势出口农产品之一，在国外久负盛誉。普洱茶的出口目的地主要是中国台湾、欧盟、日本、马来西亚、新加坡和韩国。随着国际贸易技术壁垒的升级，普洱茶主要进口地区和国家对普洱茶的农药残留、微生物含量高的问题愈来愈关注，因此对普洱茶出口检验检疫的要求也水涨船高。大肠菌群污染是食品卫生与安全的重要影响因素，食品中大肠菌群值的高低，代表了食品被粪便污染的程度，也反映对人体健康危害性的大小，是评价食品卫生质量的重要卫生指标菌[4-6]，因此检测出口普洱茶中大肠菌群的污染状况对了解出口普洱茶生产过程微生物控制及普洱茶肠道致病菌风险有着代表性的意义。

经检验鉴定发现肠杆菌科肠杆菌属细菌是出口普洱茶大肠菌群中的优势菌，共分离出85株，占大肠菌群细菌总数的65.4%，为出口普洱茶大肠菌群的主要菌属。该属中阴沟肠杆菌共有78株，在大肠菌群阳性样本中检出率达到64.3%，可见阴沟肠杆菌是出口普洱茶大肠菌群污染的主要微生物，也是出口普洱茶微生物指标合格判定中不合格率高的主要微生物风险因子。阴沟肠杆菌是人和动物的肠道正常栖息菌，在自然环境中也有大量的存在，其致病性目前所知尚不全面，报告多为医院住院感染，产生肠毒素LT或 ST 的菌株可以引起急性腹泻[7]。普洱茶参与发酵过程的主要细菌为乳杆菌、芽孢杆菌和放线菌[8]，说明出口普洱茶中检出的阴沟肠杆菌为外界污染所致。鉴于普洱茶生产包装所使用的食品接触材料是符合国家安全标准的合格产品，因此推测阴沟肠杆菌的主要污染来源是生产加工和流通过程中环境、设备和人员等因素。

出口普洱茶大肠菌群检测中发现的革兰阴性细菌中除大量的阴沟肠杆菌外还不乏对人体存在致病力的潜在致病菌，其中部分细菌可以携带强的致病能力。铜绿假单胞菌是常见的致病菌，为院内感染的主要病原菌之一，能够感染导致脓肿和败血症等[9]。伤口埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、臭味沙雷(氏)菌、泛菌属、非脱羧勒克氏菌、浅黄假单胞菌(又名浅黄金黄单胞菌)和恶臭假单胞菌均为条件致病菌，食用被其污染的食品能够导致腹泻和呕吐等食物中毒症状，近年来都曾有对人类致病的报道[10-16]。沸水作用 1-2 分钟后，茶水中大肠菌群和可疑致病菌会被杀死[17]，普洱茶在饮用过程中注意泡茶水的温度及冲泡的程序，舍弃第一泡茶汤，饮用第二泡和其后的茶汤[18],才是普洱茶安全的饮用方式。同时普洱茶在生产加工和流通过程中都应该建立良好的卫生控制和质量管理体系，才能降低潜在致病菌的污染风险，从而提高普洱茶的质量安全性，增强普洱茶的食品安全认可度，也是提高普洱茶出口贸易和普洱茶生产企业国际市场竞争力的重要手段。

1 龚加顺,周红杰.云南普洱茶化学.云南科技出版社,2011.

2 路伟尧.普洱茶发酵中微生物及酶系研究进展.云南植物研究,2008,30(6):718-724.

3 康琳.质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用.中国卫生检验杂志, 2010(10):2613-2615.

4 刘秀梅,卢行安.AOAC 991.14 PetrifilmTM大肠菌群测试片法与GB4789.3大肠菌群计数法的比较研究.中国食品学报,2010,10(6):167-172.

5 Samuel Choi，Weiping Chu，Sunny C Jiang. Application of enterococci antibiotic resistance patterns for contamination source identification at Huntington Beach. California. Marine Pollution Bulletin，2003，46 (1)： 748-755.

6 白凤翎.国家食品卫生标准大肠菌群检验方法探究.食品工业科技, 2005, 26(11):179-181.

8 许波.普洱茶发酵过程中微生物及其应用研究进展.安徽农业科学, 2010, 38(1):334-336.

9 杨君洋.铜绿假单胞菌的致病性及耐药性研究近况.内科理论与实践,2016,2:125-128.

10 薛巧.弗氏柠檬酸杆菌杆菌对动物和人致病性研究进展.动物医学进展,2015，36(7):81-85.

11 王丽凤.高毒力肺炎克雷伯菌属的致病机制研究进展.中华微生物学和免疫学杂志,2016,36(6):468-471.

12 丁红辉.从一起食物中毒中检出伤口埃希氏菌.现代医药卫生,2006,22(14):2245-2246.

13 王树峰.我国婴幼儿食品致病细菌的耐药性监测.食品安全质量检测学报, 2010, 27(2):25-30.

14 刘建忠.从汽水标本中检出臭味沙雷氏菌的报告.江苏预防医学, 2000(4):63-63.

15 王增刚.复发性口腔溃疡(ROU)合并恶臭假单胞菌感染1例报告.口腔医学, 2001, 21(2):68-68.

16 明德松.静脉导管感染浅黄金黄单胞菌耐药性及耐药机制的初步研究.全国医院感染控制、消毒管理学术研讨会, 2010.

17 王文光.普洱茶中微生物安全性的评价.普洱,2012,05:86:89.

18 赵振军.普洱茶冲泡过程中细菌的安全性分析.湖北农业科学,2014(5):1032-1035.

Analysis on pollution status and potential pathogens of coliform bacteria in exporting Pu′er tea

CHEN yun, YANG Lingchun, CHEN Liping, YIN Hong, ZHU Hongyu, FAN Yan, WANG Yigeng, Li Yunfei, WANG Wenzhen

(Yunnan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Kunming，650228，China)

The present paper aimsing at Analyzing the pollution status of coliform bacteria in exporting Pu′er teas and revealing the major factors leading to coliform contamination and discussing the risk of intestinal pathogens in exporting Pu′er teas. Enumeration of coliforms in Pu′er tea samples was detected by method recommended by the national standard GB4789.3-2010. The results showed that coliform enumeration in 12 of the 76 tested samples in 2015-2016 were above the maximum limit level. 8 species of bacteria were isolated from the tested samples andEnterobacterandKlebsiellawere major contaminated microorganism.

Export；Pu′er tea；Coliform bacteria；Potential；Pathogens

2016-12-29

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目“出口普洱茶中微生物风险因子分析”(2015IK289)。

陈芸，女，云南昆明人，理学学士，工程师，主要从事食品中微生物的检验工作。

TS272.5+4；Q939

A

0577-8921(2017)01-024-04

陈恩临.一株阴沟肠杆菌致病性的调查研究.

10.13344/j.microbiol.china.1983.03.010.