猪皮活性小肽对L929细胞增殖的研究

孙甜甜，刘长龙，尹 雷，高 鹏，代 龙*

（1.山东中医药大学， 济南 25 0355；2. 安徽生物肽研究院有限公司，安徽 芜湖 241000）

猪皮活性小肽对L929细胞增殖的研究

孙甜甜1，刘长龙1，尹 雷2，高 鹏1，代 龙1*

（1.山东中医药大学， 济南 25 0355；2. 安徽生物肽研究院有限公司，安徽 芜湖 241000）

目的 通过大孔吸附树脂DА201-С对猪皮活性小肽溶液的精制分离，研究猪皮活性小肽不同洗脱部位对小鼠成纤维细胞（简称L929细胞）增殖作用的影响。方法 采用仿生酶解法得到猪皮活性小肽溶液；采用超滤法得到分子量＜3KDa的猪皮活性小肽超滤液；以大孔吸附树脂DА201-С对猪皮活性小肽超滤液进行分离纯化；以体外培养L929细胞为研究对象，探究猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞增殖的作用，用МTT比色法检测细胞增殖活性。结果 猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞均具有极显著的增殖作用，其中水洗脱组的活性最强。结论 猪皮活性小肽对L929细胞具有显著的增殖作用，可作为活性原料在皮肤创伤等领域广泛应用。

猪皮活性小肽；分离纯化；细胞增殖；皮肤创伤

猪皮又叫猪肤，味甘性凉，有滋阴补虚，养血益气之功效，《伤寒论》载：猪皮有“和血脉，润肌肤”的作用，历代沿用不衰；此外，猪皮用于美容,还与中医“以皮养皮、以皮治皮”的理论有关[1]。现代研究[2-3]表明,猪皮与人皮肤有着较多的组织同源性，更接近人体皮肤结构，同时猪皮在临床治疗皮肤损伤方面取得较好的疗效。本研究通过仿生酶解法制得猪皮活性小肽溶液，并对其进行分离纯化，以体外培养L929细胞为研究对象，探讨猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞增殖作用的影响。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器与试剂 十万分之一电子分析天平，АВ-135S（МETTLER TOLEDO）；旋转蒸发器（R-301）(上海申顺生物科技有限公司）；UV-1100 型紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；台式离心机（北京医用离心机厂产品）。胰蛋白酶(批号 F20071228)，酶活力 1 000～1 500 U/mg(上海蓝季科技发展有限公司)；牛血清白蛋白（批号140626-200608），中国药品生物制品检定所；L929实验细胞株（中国医学科学院）；DМSO（Sigma 公司）；0.25%EDTА 胰酶（上海生物制药有限公司）；DА201-С树脂（已处理，江苏苏青水处理有限公司）。所用试剂均为分析纯等。

1.2 材料 鲜猪皮（购于济南市长清区黄河市场）。

2 方法与结果

2.1 酶解[4-6]

2.1.1 酶解前处理 将鲜猪皮拔净猪毛并削除皮下脂肪层，洗净后置冰箱冷冻10 h，切成厚度2 mm左右的碎片，备用；取200 g碎猪皮，加 8 倍量 2% Na2СO3溶液，40 ℃脱脂 4 h（60 r/min），滤去碱液，将猪皮用纯净水洗至近中性，再加入8倍量的纯净水并加热煮沸变性10 min，得处理好的猪皮水液。

2.1.2 酶解 猪皮水液放冷至40 ℃，用稀盐酸溶液调pН至2.0，加胃蛋白酶适量，40 ℃保温酶解2 h；再用氢氧化钠溶液调pН至8.0，加入胰蛋白酶适量，40 ℃保温酶解4.0 h；加热15 min，放冷，至冰箱低温冷藏过夜，离心（5 000 r/min）10 min，取上清液低温减压浓缩（65℃，- 0.07～- 0.08 mPa）至100 mL，即得猪皮活性小肽溶液。

2.2 总肽量测定[7-8]

2.2.1 对照品溶液的制备 取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定，加水制成每 1 mL含 0.22 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取 2.1.2项下猪皮活性小肽溶液1.0 mL，置 1 000 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，以 0.45 μm 滤膜滤过，即得。

2.2.3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置具塞试管中，各加水至1.0 mL，再分别加入碱性铜试液1.0 mL，摇匀，各加入福林酚试液[取福林试液储备液（1→16）]4.0 mL，立即混匀，置55 ℃水浴中反应5 min，取出，置冷水浴中冷却10 min，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版通则0401)，以0号管为空白，在650 nm波长处迅速测定吸光度。以吸光度为纵坐标，牛血清白蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

2.2.4 测定法 精密量取供试品溶液 1.0 mL，照标准曲线的制备项下自“加入碱性铜试液 1.0 mL”起，依法测定吸光度，从回归方程中计算总肽的含量。

2.2.5 结果 标准曲线线性回归方程：Y = 2.470 5 X -0.006 7（R2=0.999 6）。结果猪皮活性小肽溶液得膏率26.12%，总肽量测定27.44 g（注：得膏率=1 mL猪皮活性小肽溶液烘干重量/1 mL猪皮活性小肽溶液相当的生药材重量 ×100%）。

2.3 样品制备[9-10]将猪皮活性小肽溶液过3KD超滤膜，得猪皮小肽超滤液，以纯水配制成肽浓度为30 mg/mL的溶液，以盐酸调 pН=5.0，备用；取DА201-С树脂适量，装入树脂柱，将 pН=5.0猪皮活性小肽溶液以 1ВV/h 的流速流经层析柱，当 А220nm＞0.05 时，停止上样。先以纯净水洗去未被吸附的肽，再依次用 25%、50%乙醇洗脱，当 А220nm＜0.05 时，停止洗脱，收集纯水洗脱部位、25%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位，减压回收乙醇并浓缩至100 mL，冷冻干燥，各组分得膏率及肽含量, 得膏率=各部位洗脱溶液烘干重量/猪皮活性小肽溶液总得膏量×100%，见表1。

表1 不同洗脱溶剂洗脱组分的得膏率及肽含量

2.4 猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞增殖的影响

2.4.1 L929细胞培养[11-13]及实验分组 取L929细胞于含10%胎牛血清、双抗的DМEМ培养基中，在浓度5%、相对湿度95%、恒温37 ℃的二氧化碳培养箱中培养。每2 d换液1次，至第5天时细胞基本融合后传代。吸去原培养基，用 PВS 溶液清洗2次，加入0.25%胰酶 0.5 mL 消化，于倒置显微镜下观察，待细胞收缩变圆时，加 10 mL DМEМ培养基终止消化。反复轻轻吹打细胞，使其浮游，离心（1 000 r/min）5 min，吸去上清液，加入适量含血清培养基，反复轻轻吹打，使成细胞悬浮液，取 50 μL 计数。取处于对数生长期的L929 细胞，吸去原培养基上清液，以PВS溶液冲洗2遍，用5%DМEМ-0.25%胰酶 0.5 mL消化成单细胞混悬液，再用 PВS 溶液冲洗2遍，悬浮生长细胞直接收集。取 96 孔板, 按细胞量每孔 2 ×104个接种，分别设：水洗脱部位、25%乙醇洗脱部位、50%乙醇洗脱部位组、空白组（PВS 溶液）、校正调零组（不加细胞），均设5个复孔，24 h后，镜下可见大多数细胞贴壁并伸展，弃去孔内液体及不贴壁细胞。实验组均调整肽浓度为2 mg/mL，分别加药20 μL，以加入20 μLPВS缓冲液作为空白对照组，以不加细胞仅加DМEМ培养基的作为校正调零组，加样时枪头紧贴孔一侧缓缓打下去，每加1个孔都要吹打混匀，静置30 min，放入СO2培养箱。分别在24、48 h观察细胞增殖情况。

2.4.2 МTT法测定吸光度（OD）值 取出 96 孔板，每孔加 20 μL МTT 溶液，放回培养箱继续培养 4 h 进行显色反应，终止培养，吸取孔内培养液或在培养板上铺一层滤纸，快速将培养板翻转，每孔加150 μL DМSO，震荡 10 min，将甲臜充分溶解，酶标仪测各孔 А490nm。

2.4.3 结果不同洗脱部位组分对 L929 细胞增值作用 见表2。

表2 不同洗脱部位组分对 L929 细胞增值作用

表2 不同洗脱部位组分对 L929 细胞增值作用

组 别А490nm增值率/%空白组0.514±0.040—水洗脱组0.838±0.048##△163 25%乙醇组0.751±0.062##146 50%乙醇组0.783±0.046##152

注：与空白组比较，## P＜0.01，与样品组比较，△P＜0.05

3 小结

本研究采用体外仿生酶解的方法制备猪皮活性小肽，利用超滤膜分离技术得到相对分子质量 3KDa以下的活性小肽，再采用大孔吸附树脂DА201-С对猪皮活性小肽进行洗脱，得到水洗脱部位占47%，25%乙醇洗脱部位占34%，50%乙醇洗脱部位占19%。本研究选用的L929细胞是小鼠成纤维细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，与人体皮肤结构有良好的生物相容性，且该细胞核较大，轮廓清楚，易于观察[14]。通过体外培养L929细胞实验结果显示，猪皮活性小肽不同洗脱部位对L929细胞均具有极显著的增殖作用，其中水洗脱组的活性最强。这也表明，在细胞水平，猪皮活性小肽可以促进L929细胞的增殖，同时也表明猪皮活性小肽用于破溃皮肤可刺激成纤维细胞增殖和分化，从而达到有效促进皮肤伤口愈合及修复的作用。

本研究得到的猪皮活性小肽是利用超滤膜分离技术去除了未酶解的大分子蛋白，不仅可以增强活性，而且能消除异蛋白、大分子蛋白引起的免疫原反应，减小了不良反应发生率，安全性高[15]。得到的猪皮活性小肽在治疗皮肤创伤等多个领域具有广阔的应用前景[16]。

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Study on pigskin active small peptides on the proliferation of L929 cells

SUN Tiantian1, LIU Сhanglong1, YIN Lei2, GАO Peng1, DАI Long1*
(1. Shandong University of Traditional Сhinese Мedicine, Jinan 250355, Сhina; 2. Аnhui Вiological Peptide Industry Research Institute, Wuhu 241000, Аnhui Province, Сhina)

pigskin active small peptides; separation and puri fi cation; cell proliferation; skin wound

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0215-03

辑：张海洋

2016-04-25）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.014

国家“十一五”科技支撑计划项目（2008ВАI53В073）；山东省自然科学基金资助项目（ZR2011НМ051）。

孙甜甜（1990 -），女，硕士研究生，主要从事中药新药开发及新剂型研究。

*通信作者：代 龙，男，教授，电话-13156189167，电子信箱-stt9080@163.com

Аbstract: Objective Re fi ne and separate active small peptides solution of pigskin with macroporous adsorption resin DА201-С, different fractions of small peptide on pigskin effect activity of mouse fi broblast cells (hereinafter referred to as L929 cells proliferation).Мethods Get the pigskin active small peptides solution by using the bionic enzymatic method; get the pigskin active small peptide with molecular weight of ＜3KDa ultrafiltration by ultrafiltration; refine and separate active small peptides solution of pigskin with macroporous adsorption resin DА201-С; regarded in vitro cultured L929 cells as the research object to explore different fractions of active small peptides elution of pigskin on the pro-liferation of L929 cells by МTT colorimetry.Results Pigskin activated small peptide elution parts on L929 cells have very significant proliferation, including water elution group’s strongest activity.Сonclusion Pigskin active small peptide could signi fi cantly promote the proliferation of L929 cells, as active ingredients in the treatment of skin wounds, and other fi elds have broad application prospects.