TNF-α对大鼠肾髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表达的影响

隋洪玉，李 莹，齐淑芳，贾秀月，赵晓莲*

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007)

TNF-α对大鼠肾髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表达的影响

隋洪玉1，李 莹2，齐淑芳1，贾秀月1，赵晓莲1*

(1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)对大鼠肾髓袢升支粗段中PKA(蛋白激酶A)及其磷酸化水平蛋白表达的影响。方法：在髓袢升支粗段组织中加入10nM的TNF-α作用5min，采用免疫印迹技术观察TNF-α对PKA及其磷酸化水平蛋白表达的影响。结果：TNF-α未能明显改变大鼠肾髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平的蛋白表达(P﹥0.05)。结论：TNF-α不能改变PKA的蛋白合成及其磷酸化水平的表达。

TNF-α；髓袢升支粗段；PKA

0 引言

肿瘤坏死因子是一种具有多种生物活性的细胞因子，包括TNF-α及TNF-β两类。TNF-α主要由活化的单核细胞、巨噬细胞产生，也可在中性粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞中产生。在肾脏，TNF-α主要是由系膜细胞、近曲小管及髓袢升支粗段上皮细胞产生。大量文献表明，TNF-α与糖尿病肾病的发生发展密切相关，其被称为是糖尿病肾病发生的重要媒介物[1]。Keith DiPetrillo[2]等研究发现，糖尿病肾病大鼠早期即可出现尿TNF-α含量增高，及由TNF-α诱导的钠潴留，并证明TNF-α主要是通过增加肾远端小管钠转运导致钠潴留发生的。但TNF-α是如何增加钠重吸收进而导致钠潴留的机制不明。本实验以TNF-α为施加因素观察了其对髓袢升支粗段组织中PKA及其磷酸化水平蛋白表达的影响，以探讨PKA依赖途径是否参与了TNF-α致肾小管钠潴留的形成过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重180～220g，雌雄均可。由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供。

1.2 药品及溶液

TNF-α购于Sigma公司，PKA及p-PKA购于Santa Cruz公司。细胞外液(mmol/L)：140NaCl、5KCl、1.8CaCl2、1.8MgCl2、10HEPES(pH7.4)。

1.3 实验方法和指标测定

1.3.1 药品的配制

TNF-α先溶于去离子水中，再用细胞外液稀释成相应浓度的药液，4℃贮存备用。PKA、p-PKA、β-actin抗体用3%牛血清白蛋白(BSA)配制成实验所需浓度，二抗用5%脱脂奶粉配制成相应浓度，4℃或-20℃贮存备用。

1.3.2 免疫印迹技术

取50μg蛋白样品上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚兰到达分离胶底部后停止，取出凝胶，将含有目的蛋白的凝胶进行转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭目的蛋白1小时，继而孵育一抗及二抗，最后进行ECL显影、凝胶成像分析系统处理分析。

1.4 统计学处理

实验数据以均数±标准差表示。给药前后各项指标采用自身配对t检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 TNF-α对大鼠肾髓袢升支粗段组织中PKA蛋白表达的影响

在髓袢升支粗段组织中加入10nmol/L的TNF-α，作用5分钟后，观察其对PKA蛋白表达的影响。结果显示，10nmol/L的TNF-α不能明显改变PKA的蛋白表达(n=3，P>0.05)(见图1，图2)。

图1 TNF-α(10nmol/L)对髓袢升支粗段PKA蛋白表达的影响

图2 TNF-α(10nmol/L)对髓袢升支粗段PKA蛋白表达的影响

2.2 TNF-α对大鼠肾髓袢升支粗段组织中磷酸化PKA蛋白表达的影响

在髓袢升支粗段组织中加入10nmol/L的TNF-α，作用5分钟后，观察其对PKA蛋白表达的影响。结果显示，10nmol/L的TNF-α不能明显改变PKA的蛋白表达(n=3，P>0.05)(见图3，图4)。

图3 TNF-α(10nmol/L)对髓袢升支粗段PKA磷酸化水平的影响

图4 TNF-α(10nmol/L)对髓袢升支粗段PKA磷酸化水平的影响

3 讨论

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的并发症，是糖尿病患者的主要死因之一。DN的病理变化主要表现为肾脏肥大，肾小球和肾小管基膜增厚、胞外基质积聚及肾小球硬化等。而糖尿病肾病早期的病理变化主要表现为钠潴留，是导致高血压和肾脏肥大的原因。因高血压和肾脏肥大在糖尿病肾病患者中经常被观察到，故钠潴留可看作是糖尿病肾病早期肾功能改变的一个重要指标[3]。研究发现，由钠潴留导致的肾脏肥大主要发生在肾小管，且远端小管的改变先于近端小管。另外，近年来大量研究表明，尿TNF-α含量升高是DN早期形成的重要标志，且其含量与DN的严重程度呈正相关[4,5]。Keith DiPetrillo等证实，糖尿病肾病大鼠早期出现的尿TNF-α含量增高所致的钠潴留是通过增加肾远端小管钠转运而造成的，但TNF-α是如何增加钠转运进而导致钠潴留的机制不明。此外，由于肾远端小管对钠的转运主要发生在髓袢升支粗段，因此，本实验观察了TNF-α对髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表达的影响，以探讨PKA依赖途径是否参与了TNF-α致肾小管钠潴留的形成过程。实验结果显示，TNF-α未能明显改变大鼠肾髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平的蛋白表达，说明TNF-α导致肾小管钠潴留可能不是通过PKA依赖途径发生的。

4 结语

但PKA蛋白合成是需要一段时间完成的，而本实验中施加因素作用的时间比较短，可能还未达到PKA总蛋白含量改变的时限，只能说明TNF-α不是通过改变PKA磷酸化水平导致肾小管钠潴留发生的。因此，在今后的实验中可以利用糖尿病模型进一步探讨PKA总蛋白含量是否发生改变，以确定PKA途径是否介导了肾小管钠潴留的发生。

[1]Fernández-Real JM, Vendrell J, García I, et al.StructuraldamageindiabeticnephropathyisassociatedwithTNF-αsystemactivity. Acta Diabetol 49(4): 301-305, 2012.

[2]Dipetrillo K, Coutermarsh Bonita, Gesek FA.Urinarytumornecrosisfactorcontributestosodiumretentionandrenalhypertrophyduringdiabetes. Am J Physiol Renal Physiol 284: F113-F121, 2003.

[3]Molitch ME, DeFronzo RA, Franz MA, et al.Diabeticnephropathy. Diabetes Care 23: S69-S73, 2000.

[4]Navarro JF, Mora C, Muros M, Garcia J.Urinarytumournecrosisfactor-αexcretionindependentlycorrelateswithclinicalmarkersofglomerularandtubulointerstitialinjuryintype2diabeticpatients. Nephrol Dial Transplant 21: 3428- 3434, 2006.

[5]Wu J, Ding Y, Zhu C, et al.UrinaryTNF-αandNGALarecorrelatedwiththeprogressionofnephropathyinpatientswithtype2diabetes. Exp Ther Med 6(6): 1482-1488, 2013.

(编辑 文新梅)

Influence of Tumor Necrosis Factor-α on the Expression of Protein Kinase A and Phosphorylation Level of Renal Thick Ascending Limb of Rat

SUI Hongyu1, LI Ying2, QI Shufang1, JIA Xiuyue1, ZHAO Xiaolian1*

(1.Department of Physiology of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2.First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the effect of TNF-α on the protein expression of PKA and phosphorylation level in the thick ascending limb. Methods: The TNF-α was placed into the tissue of TAL for five minutes to observe the protein expression of PKA and phosphorylation level by using Western blot technique. Results: TNF-α did not change the protein expression of PKA and phosphorylation level in the thick ascending limb (P﹥0.05). Conclusion: The TNF-α can not change the protein expression of PKA and phosphorylation level.

tumor necrosis factor-α; thick ascending limb; protein kinase A

2016-01-05

黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助课题。课题名称：TNF-α对大鼠肾髓袢升支粗段管周膜50pS钾通道急性效应的研究；编号：12541803；主持人：隋洪玉。

隋洪玉(1976—)，女。佳木斯大学基础医学院，副教授，博士。主要研究方向：肾脏生理。

赵晓莲(1966—)，女。佳木斯大学基础医学院，教授，硕士。主要研究方向：糖尿病发病机制及预防。

R-33

B

1672-0601(2017)02-0108-03