过氧化氢等离子灭菌技术对医用材料细胞毒性影响的评价

过氧化氢等离子灭菌技术对医用材料细胞毒性影响的评价

【作 者】姚瑶，丁彪

上海市医疗器械检测所，上海市，201318

该文就过氧化氢等离子灭菌技术对11种医用材料的细胞毒性进行探讨，并与传统常规的环氧乙烷灭菌方法比较。结果显示11种材料中仅尼龙材料不适宜采用过氧化氢等离子灭菌。

过氧化氢等离子灭菌；细胞毒性

【 Writers 】YAO Yao, DING Biao

Shanghai Testing & Inspection Institute for Medical Devices, Shanghai, 201318

【 Abstract 】This paper aims to discuss the evaluation of in vitro cytotoxicity tests for eleven different medical materials using hydrogen peroxide gas plasma sterilization. Compared with ethylene oxide sterilization, the results show that only nylon material is not suitable for using hydrogen peroxide gas plasma sterilization.

随着新技术、新材料日益丰富，推动医疗器械行业快速发展，大量新型医疗器械产品不断涌现。不少器械不能采用常规高温灭菌方法，而低温灭菌技术解决了这一问题，如环氧乙烷、辐射、戊二醛等灭菌技术，其中过氧化氢低温等离子灭菌技术是近年来发展的新技术，其通过过氧化氢在舱室内扩散，将过氧化氢激励成等离子体状态，对医疗器械进行灭菌。灭菌过程的各阶段都是在干燥的低温环境下运行，因此不会损坏对热或水汽敏感的器械，对金属和非金属器械都适用。与环氧乙烷灭菌方法相比，其具有灭菌循环时间短，毒性低的优势。但是过氧化氢作为强氧化剂，对某些材料具有一定的腐蚀性。采用过氧化氢作为灭菌方式的医疗器械，为保证产品经过过氧化氢灭菌后的安全性，应对产品材料适用该灭菌技术的适宜性进行评价[1]。评价试验通常包括生化反应、细胞毒性和溶血作用等，这些试验的特点是灵敏度高、成本低和反应迅速。

该文就过氧化氢等离子灭菌技术对不同医用材料的细胞毒性进行探讨，并与传统常规的环氧乙烷灭菌方法比较，评估采用过氧化氢等离子灭菌方法对不同材料的细胞毒性的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

小鼠成纤维细胞L929（中国科学院上海细胞所），MEM细胞培养液（GIBCO），胎牛血清（HYCLONE）, 四唑盐（Sigma），二甲基亚砜（Sigma），酶标仪（BioTek），倒置显微镜（OLYMAPUS），二氧化碳培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

分别将医用不锈钢（304）、氧化铝钛镀层块、碳钢（T8）、医用聚氯乙烯（PVC）、医用ABS塑料、光导纤维、医用聚碳酸酯、硅橡胶、无纺布、丁基合成橡胶、尼龙滤网11种医用材料置于Tyvek®袋中，采用强生STERRAD®过氧化氢低温等离子灭菌器灭菌，过氧化氢浓度为5～15 mg/L，单次灭菌循环（2个灭菌周期）完成后4 h内按GB/T 16886.5—2003中规定的方法进行材料的细胞毒性试验。另将同批上述材料按GB 18279—2000采用环氧乙烷灭菌方式灭菌，按GB/T 16886.5—2003测其细胞毒性。分别用两种灭菌方式灭菌后对同种材料的细胞毒性进行比较。

1.2.2 方法

按照GB/T 16886.12—2005中的规定，将灭菌后的医用不锈钢、氧化铝钛镀层块、碳钢、ABS塑料、光导纤维、聚碳酸酯、硅胶、丁基合成橡胶材料按3 cm2/mL的比例，PVC、无纺布、尼龙滤网按6 cm2/mL的比例，加入浸提介质（含血清MEM培养基），置37oC二氧化碳培养箱中浸提24 h。取高密度聚乙烯浸提液为阴性对照，5%的二甲基亚砜（DMSO）溶液为阳性对照。取浸提液按照GB/T 14233.2—2005的四唑盐（MTT）比色法进行试验。将配制好的1×104U/mL细胞悬液接种于一块96孔培养板。设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组，每组各设6孔，每孔接种100 μL细胞悬液。置CO2培养箱（5%CO2），37oC培养24 h后弃去原培养液。空白对照组每孔加入100 μL新鲜细胞培养液，阴性对照组每孔加入100 μL阴性对照浸提液，阳性对照组每孔加入100 μL阳性对照浸提液，供试品组每孔加入100 μL供试品浸提液，置CO2培养箱继续培养72 h。每孔加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液，继续培养4 h后弃去所有液体，加入150 μL DMSO，置振荡器上振荡 10 min。在酶标仪570 nm和630 nm波长下测定吸光度。按公式计算细胞相对增殖率（RGR），RGR=供试品组（阴性、阳性组）吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。根据RGR，判定细胞毒性级别。

2 结果

不同材料采用用过氧化氢低温等离子灭菌或环氧乙烷灭菌后，各组细胞相对增殖率见图1。采用过氧化氢低温等离子灭菌的11种材料中，除丁基合成橡胶细胞毒性为2级，尼龙滤网细胞毒性为3级外，其余9种材料的细胞相对增殖率均大于80%，细胞毒性都为1级。采用环氧乙烷灭菌的材料，细胞相对增殖率均大于80%，细胞毒性皆为1级。按照GB/T 14233.2—2005中的规定，一般认为可接受的细胞毒性反应为不大于2级。可见以上11种材料，仅尼龙滤网不适宜采用过氧化氢等离子灭菌。对比两种灭菌方法，仅丁基合成橡胶及尼龙材料采用过氧化氢等离子灭菌后，材料的细胞毒性显著高于环氧乙烷灭菌。

图1 医用材料的细胞相对增殖率（两种灭菌方式）Fig.1 RGR of medical material (Comparison of two kinds of sterilization methods)

3 讨论

近几年来，过氧化氢等离子灭菌技术得到了逐步推广。对于该灭菌技术的灭菌机制目前比较认可的解释是：过氧化氢等离子体的杀菌作用是综合因素所致，主要包括温度、紫外线、高能粒子和活性自由基等。其中最主要的可能是过氧化氢自由基、羟基自由基等活性基团的作用。这些活性自由基，易与微生物体内蛋白质和核酸发生反应，破坏其新陈代谢，从而起到杀菌消毒的作用，且分解后无残留毒性[2]。与其他低温灭菌法相比较而言，灭菌用时短、毒性低、使用方便是过氧化氢等离子灭菌技术极其优越的特点[3-4]。灭菌器可以转移至各手术室间，在手术台旁操作，运行简单、灵活。

本试验采用过氧化氢等离子灭菌技术对11种常用医疗材料进行灭菌，结果显示该灭菌方法对于疏水性的和化学性能稳定材料的细胞毒性无显著影响，无接触反应、无吸收性的材料如PVC、ABS塑料、不锈钢等材料皆适用于过氧化氢等离子灭菌。而易于被氧化的材料（如丁基合成橡胶）和易于吸收过氧化氢的材料（如尼龙）最好避免使用过氧化氢等离子灭菌。目前多数腔镜器械皆使用疏水性材质，因此不耐高温、湿热的诊疗器械例如腹腔镜、电切镜、输尿管镜、关节镜等软硬式内镜，光学纤维、电池、电锯、超声刀头等皆适用过氧化氢等离子灭菌。

由于过氧化氢具有强氧化性，试验中发现，采用该灭菌方式后，对尼龙、部分橡胶弹性体的细胞毒性是有较大影响的。建议使用过氧化氢等离子灭菌器灭菌医疗器械前，应从产品说明书或者公开发表的科学文献中获取该器械是否适用该灭菌技术。产品尤其是使用新材料的产品如无法获得有效的安全信息，则应开展相应的试验来确认产品和材料经过氧化氢灭菌后，其性能和安全性是否满足要求。

[1] 国家食品药品监督管理总局. YY/T 1266-2015 适用于过氧化氢灭菌的医疗器械的材料评价[S].

[2] 倪萍. 过氧化氢低温等离子灭菌系统的工作原理及使用注意事项[J]. 医疗设备信息, 2005, 20(7): 62.

[3] 王淑艳, 张述萍, 周正红, 等. 不耐热骨科手术器械采用低温过氧化氢等离子灭菌的应用探讨[J]. 中华医院感染学杂志, 2006, 16(3): 303-304.

[4] 步秀兰. 低温等离子体在手术室腔镜器械灭菌中的应用[J]. 医学信息, 2009, 22(12): 356-357.

Evaluation of in Vitro Cytotoxicity Tests for Medical Material Using Hydrogen Peroxide Gas Plasma Sterilization

hydrogen peroxide gas plasma Sterilization, cytotoxicity

R187；R318.08

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.02.018

1671-7104(2017)02-0144-02

2016-03-21

丁彪，E-mail：41455@163.com