截断型ApoE对β-淀粉样蛋白代谢的影响

董 翔 常 庚 赵 莉 周慧玲

(大连医科大学附属第一医院神经内科,辽宁 大连 116011)

截断型ApoE对β-淀粉样蛋白代谢的影响

董 翔 常 庚 赵 莉 周慧玲

(大连医科大学附属第一医院神经内科,辽宁 大连 116011)

目的 探讨截断型(trauncated)载脂蛋白(Apo)E对β-淀粉样蛋白代谢的影响。方法 对N2a细胞进行培养，利用pEGFP-ApoE4或pEGFP-T-ApoE4质粒进行转染后制备条件培养基，利用荧光法检测全长ApoE4和truncated-ApoE4与Aβ42的结合能力，并对与Aβ42结合复合物对SDS的稳定性进行检测，利用荧光显微镜对truncated-ApoE4和全长ApoE4对影响N2a细胞结合和摄取Aβ42情况进行观察。结果 当Aβ42浓度≤100 nmol/L时，truncated-ApoE4组荧光强度均低于全长ApoE4组；进行含SDS聚丙烯凝胶电泳时，两组均在6 kD的位置处出现条带，而在43 kD处的条带明显变窄，truncated-ApoE4组大约是原来的30%，ApoE4组大约为原来的55%，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；truncated-ApoE4组N2a细胞结合和摄取Aβ42数量均少于全长ApoE4组(P<0.05)。结论 truncated-ApoE4与Aβ42结合能力减弱，形成的复合物稳定性降低，可以显著影响N2a细胞对Aβ42的结合和摄取作用，抑制truncated-ApoE4产生为AD预防和治疗提供新的研究方向。

阿尔茨海默病；载脂蛋白E；截断型ApoE；β-淀粉样蛋白

阿尔茨海默病(AD)是最为常见的痴呆类型〔1，2〕，由于患者出现失忆、认知障碍、执行障碍、行为改变等神经退变性改变，给患者日常生活造成严重影响，而且导致患者死亡风险大为增加，同时，给家庭和社会带来十分巨大的负担〔3〕。目前，AD确切的诱发因素和病理作用机制尚未十分清楚。β-淀粉样蛋白(Aβ)是脑中淀粉样前体蛋白在β-分泌酶作用下的裂解产物，以Aβ40和Aβ42为主，且Aβ42具有更强的聚集、疏水和神经毒作用〔4〕，研究发现〔5〕，AD的主要病理改变是出现大量的脑淀粉样沉淀，而Aβ是主要成分，Aβ在诱发AD发生和进展过程中发挥着至关重要的作用。载脂蛋白(Apo)E是星型胶质细胞表达的一种糖蛋白，对神经元修复和再生起重要作用，有研究指出〔6〕，ApoE4与脑淀粉样沉淀共同存在，且ApoE4频率与淀粉样沉淀形成程度呈正比，同时，ApoE4能够与Aβ形成复合物。截断型(truncated)-ApoE4是ApoE4基因C末端272～299位氨基酸残基被蛋白酶水解后的片段，研究表明〔7〕，AD患者老年斑大量存在的不是全长ApoE4，而是truncated-ApoE4。本研究对truncated-ApoE4对Aβ代谢影响进行探讨，并分析truncated-ApoE4对N2a细胞结合和摄取Aβ的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 小鼠脑神经瘤细胞N2a购自上海信则生物，pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4由大连医科大学基础医学院提供。抗载脂蛋白E购自美国Chemicon公司，Covance Beta Amyloid β-淀粉样蛋白单克隆抗体购自美国Covance公司，HRP标记羊抗兔IgG和HRP标记兔抗羊IgG均购自美国Santa Cruz公司，TRITC标记山羊抗兔IgG购自美国Jackson公司，ECL底物发光显色试剂盒购自上海远慕生物，G-418和硫酸葡聚糖凝胶柱购自美国Gibco公司，β淀粉样肽/Aβ42抗体购自瑞士Bachem公司，Lipofectamine2000转染试剂盒和Opti-MEM购自美国Invitrogen公司，ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司，F-4500荧光分光光度计购自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与质粒转染 将N2a细胞用FBS培养基于37℃、5%CO2条件下用培养箱进行培养，2 d换液一次，细胞丰度达到80%左右时，用0.125%胰酶进行消化后，用于传代或试验。用OPTI-MEM将2.7 μg纯化的pEGFP-ApoE4或pEGFP-T-ApoE4质粒稀释至250 μl，取Lipofectamine2000 5 μl稀释至250 μl，37℃下放置5 min，两者进行混匀后，37℃静置20 min后，加入到含OPTI-MEM 1.5 ml的含N2a细胞的6孔板中混匀，37℃培养6 h，换含FBS的完全培养基培养48 h，使用浓度为800 μg/ml G418进行筛选2 w，3 d换液一次。继续用浓度为400 μg/ml G418进行筛选30 d，成熟细胞即为成功转染的细胞。

1.2.2 truncated-ApoE4和全长ApoE4条件培养基的制备和纯化 将成功转染并表达truncated-ApoE4和全长ApoE4的N2a细胞分别置于250 ml培养瓶中，37℃、5%CO2条件下生长到80%细胞丰度时，用无血清培养基进行洗涤2次，并用无血清培养基进行预孵育2 h。用无血清培养基洗涤1次后，于无血清培养基中过夜培养。对培养基进行收集，保存在1 mmol/L EDTA+0.01%NaN3+10 mmol/L aprotinin+10 mmol/L benzamidine溶液中。每周进行2次收集，连续30 d。利用离心机采用2 000 r/min离心10 min，12 000 r/min离心20 min，并利用硫酸葡聚糖凝胶柱离子交换色谱法对全长ApoE4和truncated-ApoE4进行纯化。

1.2.3 truncated-ApoE4和全长ApoE4与Aβ42的结合能力检测 利用荧光法对全长ApoE4和truncated-ApoE4与Aβ42的结合能力进行检测。取纯化的全长ApoE4或truncated-ApoE4溶解于pH7.4的0.1 mol/L的Tris溶液中，分别制备成浓度为5 nmol/L的溶液，并检测荧光强度。加入Aβ42使其终浓度分别为10、20、50、100、200和500 nmol/L，进行平衡25 min后，分别检测其荧光强度。

1.2.4 truncated-ApoE4和全长ApoE4与Aβ42结合复合物对SDS稳定性检测 取冻存条件培养基30 μl和Aβ42 3.4 μl加入1 μl Tris HCL缓冲液中进行混匀孵育2 h，分别制备ApoE4、truncated-ApoE4与Aβ42结合复合物。取一部分复合物在不含SDS聚丙烯凝胶板上进行电泳后转膜，利用Covance Beta Amyloid β-淀粉样蛋白1-16(6E10)单克隆抗体进行检测；另取一部分在含有SDS聚丙烯凝胶板上进行电泳，检测方法同上。

1.2.5 truncated-ApoE4和全长ApoE4对N2a细胞结合和摄取Aβ42影响检测 取冻存条件培养基30 μl和Aβ42 3.4 μl加入1 μl Tris HCl缓冲液中进行混匀孵育2 h，①取35 μl混合液加入无血清培养基并定容至3 ml，在4℃条件下对N2a细胞进行孵育30 min，弃上清加入4%多聚甲醛进行固定，利用PBS冲洗3次，每次5～10 min，加入1∶200比例稀释β淀粉样肽/Aβ42抗体进行过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5～10 min，加入1∶50稀释的TRITC标记山羊抗兔lgG室温孵育2 h，PBS冲洗3次，每次5～10 min，甘油封片后，对细胞结合能力进行观察。②取35 μl混合液加入无血清培养基并定容至3 ml，在37℃条件下对N2a细胞进行孵育60 min，弃上清加入4%多聚甲醛进行固定20 min，利用PBS冲洗3次，每次5～10 min，用含0.3%Triton X-100的PBS进行破膜5～10 min后，其余步骤同细胞结合能力检测试验。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，χ2检验。

2 结 果

2.1 truncated-ApoE4、全长ApoE4与Aβ42结合能力情况 利用荧光法对truncated-ApoE4、全长ApoE4与Aβ42结合能力进行检测， truncated-ApoE4和全长ApoE4均能与Aβ42以饱和方式进行结合，当Aβ42浓度≤100 nmol/L时，truncated-ApoE4组荧光强度均低于全长ApoE4组，见表1。

表1 不同Aβ42浓度下truncated-ApoE4组和ApoE4组荧光强度变化情况

2.2 truncated-ApoE4、全长ApoE4与Aβ42结合复合物对SDS稳定性 利用含SDS和不含SDS的聚丙烯凝胶对truncated-ApoE4、全长ApoE4与Aβ42结合复合物稳定性进行检测，进行不含SDS聚丙烯凝胶电泳时，两组均能够在43 kD的位置进行凝聚，出现粗的凝聚条带。当进行含SDS聚丙烯凝胶电泳时，两组均在6 kD的位置处出现条带，而在43 kD处的条带明显变窄，truncated-ApoE4组大约是原来的30%，ApoE4组大约为原来的55%，两组差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：不含SDS聚丙烯凝胶电泳；B：含SDS聚丙烯凝胶电泳图1 truncated-ApoE4、全长ApoE4与Aβ42结合复合物对SDS稳定性

2.3 truncated-ApoE4和全长ApoE4对N2a细胞结合和摄取Aβ42影响 由图2A和图2B可知，truncated-ApoE4组N2a细胞结合Aβ42数量显著少于全长ApoE4组(P<0.05)；由图3A和图3B可知，truncated-ApoE4组N2a细胞摄取Aβ42数量显著少于全长ApoE4组(P<0.05)。见图2，图3。

图2 truncated-ApoE4和全长ApoE4对N2a细胞结合Aβ影响

图3 truncated-ApoE4和全长ApoE4对N2a细胞摄取Aβ影响

3 讨 论

研究表明〔8〕，老年斑、神经元缺失、神经纤维缠结等是AD主要病理改变。而Aβ是老年斑的重要组成成分，其在脑组织中过度表达、聚集和沉淀能够加速老年斑的形成，从而加快AD病程进展〔9〕。ApoE是在神经元修复和再生起重要作用一种糖蛋白，能够调节Aβ的代谢、聚集和沉淀，可以和Aβ结合成可溶性的复合物，并能抵抗SDS的变性作用，ApoE4是ApoE的一个亚型，能够增加AD的患病风险，可能与其影响Aβ聚集沉淀有关〔10〕，truncated-ApoE4是ApoE 4是蛋白酶水解产物，有研究指出〔11〕，truncated-ApoE4在AD病程中的作用远强于ApoE 4。本研究对truncated-ApoE4和ApoE 4对Aβ代谢作用，以及对N2a细胞结合和摄取Aβ的影响进行了系统探讨，鉴于脑组织中Aβ以Aβ40和Aβ42为主要组成，且Aβ42具有更强的聚集、疏水和神经毒作用〔4〕。

本研究说明truncated-ApoE4与Aβ42结合能力显著低于全长ApoE4的结合作用，truncated-ApoE4的结合产物对SDS变性作用显著降低，出现了大量的游离Aβ42，并且游离的Aβ42进行了聚集，出现了凝聚条带，提示游离的Aβ42更具有聚集的特性〔12〕。本研究显示truncated-ApoE4可以影响N2a细胞对Aβ42的结合和摄取作用，进一步从分子水平上说明了truncated-ApoE4对Aβ42代谢的影响作用。

1 Pillai JA,Bonner-Jackson A,Walker E,etal.Higher working memory predicts slower functional decline in autopsy-confirmed Alzheimer′s disease〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord,2014;38(3-4):224-33.

2 Chan KY,Wang W,Wu JJ,etal.Epidemiology of Alzheimer′s disease and other forms of dementia in China,1990-2010:a systematic review and analysis〔J〕.Lancet,2013;381(9882):2016-23.

3 Jiang T,Yu JT,Tian Y,etal.Epidemiology and etiology of Alzheimer′s disease:from genetic to non-genetic factors〔J〕.Curr Alzheimer Res,2013;10(8):852-67.

4 Pobandt T,Knecht V.Free energy of lipid bilayer defects affected by Alzheimer′s disease-associated amyloid-β42 monomers〔J〕.J Phys Chem B,2014;118(13):3507-16.

5 Panza F,Frisardi V,Solfrizzi V,etal.Immunotherapy for Alzheimer′s disease:from anti-β-amyloid to tau-based immunization strategies〔J〕.Immunotherapy,2012;4(2):213-38.

6 Yu L,Boyle PA,Leurgans S,etal.Disentangling the effects of age and APOE on neuropathology and late life cognitive decline〔J〕.Neurobiol Aging,2014;35(4):819-26.

7 Bien-Ly N,Andrews-Zwilling Y,Xu Q,etal.C-terminal-truncated apolipoprotein (apo)E4 inefficiently clears amyloid-beta (Abeta)and acts in concert with Abeta to elicit neuronal and behavioral deficits in mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2011;108(10):4236-41.

8 Kastyak-Ibrahim MZ,Di Curzio DL,Buist R,etal.Neurofibrillary tangles and plaques are not accompanied by white matter pathology in aged triple transgenic-Alzheimer disease mice〔J〕.Magn Reson Imaging,2013;31(9):1515-21.

9 Bloom GS.Amyloid-β and tau:the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis〔J〕.JAMA Neurol,2014;71(4):505-8.

10 Kanekiyo T,Xu H,Bu G.ApoE and Aβ in Alzheimer′s disease:accidental encounters or partners〔J〕.Neuron,2014;81(4):740-54.

11 Zhou J,Chen J,Feng Y.Effect of truncated-ApoE4 overexpression on tau phosphorylation in cultured N2a cells〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2006;26(3):272-4.

12 Mayes J,Tinker-Mill C,Kolosov O,etal.β-amyloid fibrils in Alzheimer disease are not inert when bound to copper ions but can degrade hydrogen peroxide and generate reactive oxygen species〔J〕.J Biol Chem,2014;289(17):12052-62.

〔2015-03-25修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

常 庚(1981-)，男，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事痴呆研究。

董 翔(1975-)，男，博士，副主任医师，主要从事脑血管病及痴呆研究。

R743

A

1005-9202(2017)07-1621-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.023