姜黄素增强脂多糖跨膜转运的机制及其抗动脉粥样硬化作用

周音频 宁 琳 向立权 吴永才 杨义航 黎 明

(重庆市涪陵区中心医院心内科，重庆 408000)

姜黄素增强脂多糖跨膜转运的机制及其抗动脉粥样硬化作用

周音频 宁 琳 向立权 吴永才 杨义航 黎 明

(重庆市涪陵区中心医院心内科，重庆 408000)

目的 探究姜黄素增强脂多糖(LPS)跨血管内皮细胞的转运机制及其抗动脉粥样硬化作用。方法 采用TER法检测姜黄素处理后心肌细胞通透性的变化，放射法检测姜黄素处理的心肌细胞内LPS流出率， Western印迹法检测心肌细胞内小窝蛋白(Cav)-1的表达，qRT-PCR法检测姜黄素作用后的小鼠心肌细胞内层VCAM-1、ICAM-1的基因表达。结果 与对照组比较,不同浓度姜黄素处理后的心肌细胞单层电阻值逐渐增加；心肌细胞膜内的LPS流出率下降，随着姜黄素浓度升高，其流出率逐渐降低，与剂量浓度呈负相关。与对照组相比，姜黄素处理后Cav-1蛋白表达量均下降，随着时间的延长表达量逐渐降低，在药量浓度范围内呈负相关。姜黄素处理过的心肌细胞内VCAM-1、ICAM-1基因表达量均升高且与姜黄素浓度呈负相关，随着姜黄素药物作用浓度的升高，VCAM-1、ICAM-1基因表达量逐渐降低。结论 姜黄素通过提高细胞通透性加强LPS在小鼠心肌内皮细胞转运，并且通过调控VCAM-1、ICAM-1基因抑制动脉粥样硬化的形成。

姜黄素；心肌细胞；脂多糖;小窝蛋白-1;动脉粥样硬化

姜黄素是从植物Curcuma longa L.中提取到的多酚物质，难溶于水，易溶于乙醇、氯仿等有机溶剂〔1〕。临床研究证明，姜黄素在抗肿瘤、治疗心血管疾病方面具有良好的效果〔2〕。Chang等〔3〕研究发现姜黄素通过抑制MDR1蛋白的表达可诱导口腔癌细胞凋亡且对牙龈的毒性小。赵秀峰等〔4，5〕证实姜黄素对小鼠心肌缺血性细胞损伤具有保护作用。本文主要对姜黄素增强脂多糖(LPS)跨膜转运的机制及其抗动脉粥样硬化作用进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 材料 体重约为150 g的健康小鼠20只由第三军医大学动物实验室饲养；姜黄素由重庆市中药研究所提供。

1.2 实验试剂及器材 胎牛血清，Gibco公司；DMEM，Invitrogen公司；胰酶，Thermo Scientific 公司；RPMI-1640培养基，Gibco公司；MTT，华美公司；兔抗大鼠 p-Caveolin-1、GAPDH 等一抗抗体，北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG，北京博胜经纬科技有限公司；聚丙烯酰胺、Tris-HCl、NC膜，Amersham公司；EDTA，Amresco公司；Transwell小室，北京优尼生物科技有限公司；MERS00002型跨膜细胞电阻仪，美国Millipore 公司；SYBRTM Premix Ex TaqⅡ，Takara公司;Bio-Red荧光定量PCR仪，Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌细胞的培养 将20只小鼠随机分为五组，每组4只。对照组灌输生理盐水，治疗组和模型组小鼠提前3 d给予脂多糖(LPS)喂养，治疗组分别灌输姜黄素(0.3 g/L)一倍药量、两倍药量、三倍药量、四倍药量，2次/d，5 d后将小鼠用4%水合氯醛麻醉，麻醉后将小鼠解剖取出心脏，迅速置于100 ml PBS溶液中，清洗3次，用无菌剪刀去除心脏表面的组织血管等，用PBS溶液清洗后，将组织用剪刀剪成1 mm3大小的组织块放入锥形瓶，加入2 g/L的胰酶置于37℃摇床100 r/min培养30 min，将上层细胞悬浮液用移液枪吸取后，加入含10%胎牛血清的DEME，混匀后得到心肌细胞，将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中，当细胞贴壁数目达到80%时加入0.5%胰酶溶液进行消化，按照1∶3进行传代培养，培养的第三代细胞用于后续实验。

1.3.2 采用TER法检测姜黄素作用后心肌细胞通透性的变化 在体外将不同药量处理后的5组小鼠心肌细胞接种于DMEM液体培养基37℃培养1 d，加入胰酶消化细胞，使细胞浓度为1.5×105个/ml，取100 μl接种于六孔板置于Transwell上室中，上下室内均加入500 μl DMEM培养液，上室中细胞培养分为5组，每组四个重复，细胞培养至单层，用电阻仪检测上下室之间的电阻值，观察细胞通透性的变化。

1.3.3 放射法检测含药的心肌细胞的通透性 将体外5组培养生长到对数期的细胞接种于加入〔3〕H标记LPS的DMEM液体培养基中，培养1 d待反应结束后加入不含血清DMEM液体培养基漂洗2次，加入含5%BSA的DMEM液体培养基和载体蛋白apoA-I后连续培养6 h，设置阴性对照为不加载体蛋白apoA-I，分别收集上清培养基和破裂细胞，用0.22 μm的微孔过滤器过滤，PBS溶液清洗2次，取上清和裂解细胞液200 μl，用液闪计数仪测定上清、细胞及阴性对照细胞〔3〕H内毒素放射量，内毒素的流出率=(上清〔3〕H内毒素放射量-阴性对照量)/(总〔3〕H内毒素放射量)。

1.3.4 Western印迹法检测小窝蛋白(Cav)-1蛋白的表达 参照Triton-100细胞裂解液膜蛋白试剂盒进行裂解后细胞内Cav-1蛋白的提取，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度的测定，配置8%的分离胶与5%的浓缩胶，蛋白样品中加入1/2体积的SDS上样缓冲液，每孔上样蛋白10 μg，Marker 5 μl，50 V电压30 min，待指示剂进入分离胶后100 V电压至电泳结束。以兔抗鼠Cav-1、PKC、P-ERM、ERM抗体作为一抗，4℃过夜转膜，用PBS-T洗膜4次，按照(1∶5 PBS-T稀释)加入二抗，室温下反应1 h，用PBS-T洗膜4次。用ELC试剂盒检测发光剂显影，之后采用凝胶成像仪保存图像。

1.3.5 qRT-PCR检测姜黄素作用后细胞内皮ICAM-1、VCAM-1基因表达 采取最佳姜黄素处理浓度1.2 g/L灌喂治疗组小鼠后提取心肌组织内皮RNA，参照RNA试剂盒进行操作，参照cDNA反转录试剂盒进行RNA反转录，根据ICAM-1的序列设计引物序列：正义:5′-AGGTATCCATCCATCCCACA-3′，反义：5′-AGT-GTCTCATTCCCACGGA-3′；VCAM-1的引物:反义:5′-CGGTCATGGTCAAGTGTTTG-3′，正义:5′-GAGATCCAGGGGAGATGTCA-3′。内参β-actin序列：反义:5′-CGTTGACATCCGTAAAGA-3′，正义:5′AGCCACCAATCCACACAG-3′。反应体系：SYBRTM Premix Ex TaqⅡ 10 μl，ddH2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板1 μl。在Bio-Red荧光定量PCR仪上按照反应程序94℃变性3 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；40个循环；95℃ 1 min进行反应，以β-actin基因为内参，采用2-ΔΔcq算法进行基因表达数据的分析。

1.4 统计学分析 使用GraphPad Prism 5 统计学软件行方差分析并绘图。

2 结 果

2.1 TER法检测姜黄素作用心肌细胞后单细胞层的电阻值 对照组随着时间的增加，细胞膜的通透性并未发生明显的变化。与对照组比较，姜黄素处理后的心肌细胞层的电阻值降低，并且随着姜黄素浓度增加，细胞的通透性逐渐升高。见表1。

2.2 放射法检测含药的心肌细胞〔3〕H LPS流出率 姜黄素作用后的小鼠心肌细胞膜内的LPS流出率与对照组相比下降；随着姜黄素浓度的升高，流出率逐渐降低，与剂量浓度呈现负相关。见表1。

组别电阻值TER(Ω,×cm2)流出率(%)对照组19.21±0.6311.74±0.46模型组31.52±0.397.69±0.570.3g/L姜黄素28.68±0.5410.23±0.741)0.6g/L姜黄素22.59±0.751)12.38±0.651)0.9g/L姜黄素18.52±0.761)14.37±0.362)1.2g/L姜黄素15.27±0.662)16.07±0.262)

与对照组相比：1)P<0.05；2)P<0.01

2.3 姜黄素作用后对心肌细胞Cav-1蛋白表达的影响 与对照组相比，姜黄素处理后Cav-1蛋白表达量均下降，且随着时间的延长，表达量逐渐降低，在药量浓度范围内呈负相关，表明姜黄素处理后转运蛋白Cav-1量降低,减少了细胞的炎症反应。见图1。

a:对照组；b：模型组;c:治疗组+0.3 g/L姜黄素;d:治疗组+0.6 g/L姜黄素;e：治疗组+0.9 g/L姜黄素;f:治疗组+1.2 g/L姜黄素；下图同图1 姜黄素处理后细胞膜内Cav-1蛋白的表达

2.4 姜黄素作用后细胞内皮ICAM-1、VCAM-1蛋白表达量 与对照组(1.02±0.82，1.00±0.85)不做任何处理的心肌细胞对比，LPS处理过的心肌细胞内VCAM-1、ICAM-1蛋白表达量(1.98±0.62,2.34±0.18)均升高，且与姜黄素浓度呈负相关；随着姜黄素药物作用浓度的升高，VCAM-1、ICAM-1基因和蛋白的表达量逐渐降低(0.3、0.6、0.9、1.2 g/L姜黄素组分别为1.74±0.15，1.49±0.36；1.25±0.62，1.28±0.14；0.96±0.56，0.89±0.21；0.73±0.17，0.80±0.11)。表明姜黄素可能通过调控VCAM-1、ICAM-1基因抑制动脉粥样硬化的形成。见图2。

图2 姜黄素作用后细胞内皮ICAM-1、VCAM-1蛋白表达

3 讨 论

姜黄素通过抑制LPS诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生，进而抑制过氧化物的产生起到消炎的作用〔6〕。有研究表明姜黄素能够抑制血管生成，其主要通过抑制肿瘤细胞的增殖进而促进血管内皮细胞迁移，并且对血管的抑制具有特异性〔7〕。

体内发生炎症反应时，LPS、TNF-α会使内皮细胞产生间隙，细胞通透性升高〔8〕。本研究通过TER法检测单细胞层的电阻值，表明心肌细胞的通透性升高，姜黄素可能通过增加心肌细胞的通透性使LPS在内皮细胞膜间运输。TER法(跨膜电阻测定)一般分为两种：接触式与非接触式培养〔9〕，两者区别在于组织内皮细胞和组织细胞接种于培养室的两侧，二者之间的细胞间物质是否可以进行自由交换〔10〕,接触式培养主要研究组织细胞之间的相互作用，非接触式培养研究细胞间物质的运输，张水华等〔11〕通过非接触式培养法测定血脑屏障模型的TER。TER法关键的技术操作在于组织细胞单层细胞的培养及接种浓度的确定，若非单层细胞或细胞浓度过高，均会影响实验结果〔12〕。Cav-1是位于胞膜上的凹陷囊状结构，体内广泛存在，主要参与细胞增殖、肿瘤、凋亡等生命活动〔13〕。已有研究证实，Cav-1基因沉默会导致细胞通透性增强〔14〕。Jie等〔15〕研究发现脑缺血后,Cav-1的表达升高，从而诱导claudin-5的表达,表现出脑部组织水肿。本实验结果表明姜黄素通过抑制Cav-1蛋白的表达，降低了膜上LPS等大分子的运输，增强细胞的自我保护能力，但对于具体参与抑制Cav-1蛋白的信号路径尚未清楚，还需要进一步深入研究。

放射性核素标记法是检测微量物质的一种实验方法，具有操作简单、灵敏度高、作用范围广，在医学及生物界广泛应用〔16〕。本实验表明姜黄素可能是通过抑制LPS跨膜转运而对细胞进行保护。同位素标记法实验也存在局限性：(1)标记后的化合物其生化结构稳定性降低，(2)辐射后化合物自身分解，(3)标记的原子会因为结构的不稳定发生移动造成实验错误〔17〕。因此，在实验操作过程中要控制好放射标记物反应的时间。 动脉粥样硬化是常见的心脑血管疾病之一，伴随着炎症反应的发生，寻找新型抗动脉粥样硬化药物是当前主要任务〔18〕。姜黄素除了在治疗心血管病方面发挥着重要的作用外，在抑制动脉粥样硬化方面也起到了良好的效果〔19〕。 研究发现他汀类药物具有抗动脉粥样硬化的作用，主要是通过抑制GTP酶的表达而起到消炎的作用〔20〕。P 选择素抑制剂 PSI-697能有效降低小血管表皮白细胞的聚集，减小表面脂块的大小，起到消炎及抗动脉粥样硬化的作用〔21〕。 ICAM-1、VCAM-1基因在动脉粥样硬化的炎症反应中起着关键重要作用，负责血管内皮表面白细胞的迁移、聚集。ICAM-1、VCAM-1基因表达量升高可促进内皮细胞之间黏附，进而在血管表面形成脂块。本实验表明姜黄素通过调节心肌细胞表皮ICAM-1、VCAM-1基因的表达来抑制炎症的产生，从而抑制动脉粥样硬化的产生。姜黄素作为良好的心血管、逆肿瘤中药，具有廉价、高效、对人体副作用好，体外实验误差小等优点。

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〔2016-08-08修回〕

(编辑 郭 菁)

重庆市医学科研计划项目(No.2013-1-056)

周音频(1969-)，男，博士， 副主任医师，主要从事心内科疾病研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)07-1617-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.021