B7-H4分子在肺癌中的表达及其与Treg细胞的关系

王 鑫 刘 洁 李虎子

(天津医科大学总医院肿瘤内科，天津 300052)

B7-H4分子在肺癌中的表达及其与Treg细胞的关系

王 鑫 刘 洁1李虎子2

(天津医科大学总医院肿瘤内科，天津 300052)

目的 探讨肺癌小鼠中B7-H4分子的表达与调节性T细胞(Treg)的变化及两者之间的相关性。方法 C56BL/6雌性小鼠24只随机分成对照组和肺癌组各12只。对照组小鼠皮下注射0.1 ml无菌生理盐水；肺癌组小鼠皮下注射浓度为1×107/ml的0.1 ml Lewis肺癌细胞株悬液，于注射后14 d处死小鼠，通过苏木素-伊红(HE)染色验证肺癌模型；酶联免疫吸附(ELISA)检测肺癌组织以及腹腔来源的巨噬细胞培养上清中白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ的分泌量；流式细胞术检测小鼠肺癌组织以及腹腔来源的巨噬细胞表面B7-H4的表达以及脾脏、淋巴结中Treg细胞的比例及数量；并进一步分析其相关性。结果 与对照组比，肺癌组小鼠高表达B7-H4分子，并且分泌更多的IL-10、TNF-α以及较少的IFN-γ(P<0.05)；肺癌小鼠的脾脏、淋巴结中的Treg细胞比例以及总数均显著高于对照组(P<0.05)；Treg细胞的绝对数与B7-H4的蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.64，P<0.05)。结论 在肺癌中，B7-H4分子高表达并与Treg细胞相互作用，对肿瘤的免疫调节发挥作用。

B7-H4；调节性T细胞；肺癌；白细胞介素-10

大多数肺癌患者就诊时已是中晚期，治疗效果较差，术后5年生存率低于15%〔1，2〕。研究表明恶性肿瘤患者的免疫处于耐受或缺陷状态，机体通过改变表面分子的表达水平、分泌抑制性细胞因子及封闭表面抗原等方式逃避机体的免疫机制从而发生发展〔3，4〕。B7-H4分子是最近研究发现的一种与肿瘤免疫逃逸相关的分子，在正常组织中有大量mRNA水平的表达，但是蛋白质水平的表达较低，而在肿瘤细胞中，B7-H4分子在mRNA水平以及蛋白水平均高表达，可以通过抑制T细胞增殖和细胞因子分泌对T细胞的免疫应答进行负性调控〔5，6〕。调节性T细胞(Treg)是在肿瘤免疫耐受过程中发挥着重要作用的一种CD4+T细胞亚群，其关键转录因子为FoxP3，主要分泌的抑制性因子为白细胞介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)-β和IL-35等〔7，8〕。Treg细胞通过产生的IL-10能够抑制肺癌肿瘤细胞的增殖。本研究分析B7-H4在肺癌组织中的表达以及Treg细胞比例和数量的变化，分析两者之间可能存在的联系，探讨B7-H4在肺癌免疫逃逸机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 小鼠分组及构建肺癌模型 24只6～8 w的C56BL/6雌性小鼠购自中国科学院上海实验动物中心，SPF级实验室饲养，约15～20 g。小鼠肺癌细胞株Lewis购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，在本实验室常规传代培养，取对数生长期细胞，用胰酶消化，离心后收集细胞，调整细胞密度为1×108个/ml。随机分成对照组及肺癌组，取小鼠Lewis肺癌细胞系培养后收集细胞，用生理盐水重悬后台盼蓝染色，细胞活力>95%，取细胞进行计数，调整浓度为1×107/ml。肺癌组小鼠12只，皮下注射肺癌细胞株悬液0.1 ml，浓度为1×107/ml；对照组小鼠12只，皮下注射0.1 ml无菌生理盐水。两组小鼠于接种后14 d断颈处死。两组小鼠的体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 组织病理切片 取小鼠肿瘤组织最大面，避开过多的坏死组织部分，连续切片，厚度约2～3 mm，用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，苏木素-伊红(HE)染色。显微镜下观察组织病理。

1.3 流式细胞术测B7-H4的表达 荷瘤小鼠的肺癌组织用Ⅳ型胶原酶37℃消化后，过100目无菌滤网，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后重悬细胞，浓度为2×106/ml，贴壁1.5 h后收集贴壁细胞；腹腔巨噬细胞用PBS作为腹腔灌洗液收集，收集后2 000 r/min离心10 min，取出后弃上清，将得到的细胞用完全1640重悬，置于孵箱5%CO2，37℃培养，24 h后用PBS洗去非黏附细胞，对贴壁细胞反复吹打得到腹腔巨噬细胞，经流式检测其纯度达到90%以上。用APC-F4/80、PE-B7-H4(购自美国BD公司)染色后分析，取正常小鼠、荷瘤小鼠腹腔来源的巨噬细胞，用PE-B7-H4孵育30 min，4℃，PBS洗涤2次后，重悬细胞，4%多聚甲醛固定后用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测。

1.4 流式细胞术检测调节性T细胞的比例 通过断颈将小鼠处死，提取小鼠脾脏、肠系膜淋巴结，研磨制成单细胞悬液，并进行白细胞计数，调整细胞悬液浓度，并取2×106个细胞用PE-CD4、FITC-CD25、APC-FoxP3(购自美国BD公司)标记Treg细胞，避光孵育后PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定后进行流式细胞学检测，采用FlowJo分析得出Treg细胞占总CD4+T细胞的比例，并换算出Treg细胞的数量。

1.5 酶联免疫吸附(ELISA)检测IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ的分泌量 按照ELISA试剂盒(购自R&D公司)说明书，将上述取得的巨噬细胞采用完全培养基在体外培养24 h，收集培养上清，梯度稀释后加入包被好的反应孔中，37℃孵育1 h后洗涤，在反应孔中加入稀释后的酶标抗体，37℃孵育1 h后加入显色液，37℃孵育30 min后终止反应，用酶标仪(Bio-Rad model 550)在450 nm处检测OD值。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD多重比较及Pearson相关分析。

2 结 果

2.1 HE染色验证肺癌模型的建立 皮下接种肺癌细胞株，成瘤率100%，并且在14 d后进行剖杀，取肿瘤组织进行HE染色，在显微镜下观察到癌细胞被纤维组织分隔成大小不等的癌巢，癌细胞呈圆形或椭圆形，细胞大小不等，胞质呈偏嗜碱性。见图1。

图1 肺癌组织HE染色

2.2 流式细胞术检测小鼠B7-H4分子的表达 同型对照小鼠B7-H4表达(0.6±0.3)%，对照组巨噬细胞B7-H4分子表达非常微弱〔(2.4±0.5)%〕，而荷瘤小鼠腹腔来源及肿瘤组织来源的巨噬细胞B7-H4表达〔(20.3±2.0)%,(17.2±3.1)%〕均明显高于正常小鼠腹腔来源的巨噬细胞上的B7-H4表达(P<0.05)。

2.3 各组巨噬细胞分泌的IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比较 肺癌组巨噬细胞分泌的IL-10〔肺癌组织：(506±10)pg/ml，腹腔：(562±18)pg/ml〕、TNF-α〔肺癌组织：(1 605±139)pg/ml，腹腔：(1 780±115)pg/ml〕水平明显高于对照组〔(254±13)pg/ml、(527±28)pg/ml〕(P<0.05)，而IFN-γ水平〔肺癌组织：(95±8)pg/ml，腹腔：(172±10)pg/ml〕明显低于对照组〔(738±40)pg/ml〕(P<0.05)。

2.4 流式细胞术检测脾脏、淋巴结中Treg细胞的比例和数量 肺癌组小鼠脾脏以及淋巴结中的Treg细胞比例〔(13.7±1.8)%、(16.2±2.8)%〕以及数量〔(720±97)×103,(350+15)×103〕均显著高于对照组〔(3.3±0.4)%、(4.9±0.4)%；(312±68)×103,(119±21)×103〕(P<0.05)。

2.5 B7-H4分子表达水平与Treg细胞绝对数的相关性 Treg细胞的绝对数即小鼠脾脏、淋巴结中Treg细胞的总数与B7-H4分子的蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.64，P<0.05)。

3 讨 论

Treg细胞有着独特的免疫负调节作用，当Treg细胞过多时，机体中的正常免疫系统受到抑制，将无法正常发挥免疫效应，而当Treg细胞过少时，则会发生自身免疫性疾病〔9〕。研究发现，肿瘤患者体内免疫效应降低，免疫缺失与患者体内更多的CD4+CD25+FoxP3+的Treg细胞密切相关〔10〕。提示在肺癌发生发展的过程中，Treg细胞占总CD4+T细胞的比例不断增加，将增强机体其他免疫细胞的抑制作用，而机体免疫效应细胞的能力减弱，肿瘤得以进一步发展，增加了肿瘤细胞发生免疫逃逸的可能。B7-H4分子作为新近发现的负性调节分子在肿瘤中的作用逐渐受到关注，研究发现，在结肠癌、侵袭性导管癌等肿瘤中B7-H4分子高度表达，并且可以抑制效应T细胞的功能。本实验研究发现正常小鼠腹腔来源的巨噬细胞仅微弱表达B7-H4分子，而荷瘤小鼠无论是腹腔来源还是肿瘤组织来源的巨噬细胞均高表达B7-H4分子，提示在肺癌形成的微环境中B7-H4分子可能发挥着重要的作用。本文进一步检测了多种炎症因子，结果提示B7-H4分子可能是通过分泌IL-10、TNF-α等细胞因子作用于T细胞发挥免疫逃逸的作用。另外，进一步观察了免疫抑制细胞Treg在肺癌小鼠脾脏、淋巴结中的变化，结果提示B7-H4分子在肿瘤发生发展中与Treg细胞之间可能存在相互作用的关系，B7-H4分子可能是通过分泌大量的IL-10、TNF-α作用于Treg细胞对免疫调节发挥作用的。然而，B7-H4分子到底是否通过细胞因子IL-10、TNF-α作用于Treg细胞还有待进一步的研究。本研究为肿瘤免疫逃逸现象的机制研究提供了新的实验依据，并为肺癌治疗提供了新的靶标。

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4 Kantoff PW，Higano CS，Shore ND，etal.Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer〔J〕.N Engl J Med，2010；363(5)：411-22.

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10 Cao C，Ma T，Chai YF，etal.The role of regulatory T cells in immune dysfunction during sepsis〔J〕.World J Emerg Med，2015；6(1)：5-9.

〔2016-12-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

1 天津市第三中心医院呼吸科 2 天津中医药大学第一附属医院呼吸科

刘 洁(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事呼吸道肿瘤研究。

王 鑫(1985-)，男，硕士，住院医师，主要从事呼吸、泌尿肿瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1611-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.018