抗纤软肝胶囊对大鼠肝纤维化肝星状细胞活化及凋亡的影响

2017-04-20刘黎明胡东辉张建军

中国老年学杂志 2017年7期

关键词：活化纤维化胶囊

刘黎明胡东辉张建军

(湖北中医药大学，湖北武汉 430065)

抗纤软肝胶囊对大鼠肝纤维化肝星状细胞活化及凋亡的影响

刘黎明胡东辉1张建军1

(湖北中医药大学，湖北武汉 430065)

目的探讨抗纤软肝胶囊对大鼠肝纤维化肝星状细胞(HSC)活化及凋亡的影响。方法将32只清洁级SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组和肝纤维化建模组各16只。建模组大鼠皮下注射四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化，正常对照组以同样方法注射等量植物油，随后将正常对照组随机分为正常组8只，药物组8只，建模组随机分为模型组8只，治疗组8只。药物组、治疗组均给予抗纤软肝胶囊治疗，其他组同期灌服相当量的生理盐水。应用苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色观察各组肝脏病理组织学改变；检测各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ-C型胶原(Ⅳ-C)及Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)水平；RT-PCR法或流式细胞术检测各组血清体外对HSC-T6细胞中α平滑肌动蛋白(α-SMA)和转化生长因子(TGF)-β1 mRNA表达以及细胞凋亡水平的影响。结果与模型组大鼠比较，治疗组大鼠肝脏的肝纤维化程度减轻；治疗组血清ALT、AST、HA、LN、IV-C、PC-Ⅲ水平明显低于模型组，而ALB水平明显高于模型组(均P<0.05)；体外实验发现药物组及治疗组α-SMA和TGF-β1 mRNA的表达水平显著低于正常组及模型组(均P<0.05)。流式细胞术检测结果显示，药物组及治疗组HSC-T6的凋亡水平显著高于正常组及模型组(均P<0.05)。结论抗纤软肝胶囊通过参与调控HSC的活化及凋亡，可发挥对肝纤维化大鼠的治疗作用。

抗纤软肝胶囊；肝纤维化；肝星状细胞；凋亡

肝星状细胞(HSC)是肝纤维化的细胞学基础〔1〕。在正常状态下，HSC处于肝窦周围间隙中，通过释放可溶性炎性因子和产生细胞外基质(ECM)来促进肝细胞间的相互作用。当肝脏受到各种刺激因素的作用发生损伤后，HSC将被激活〔2，3〕。活化的HSC分泌更多的ECM，包括α平滑肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ等；此外，HSC也分泌基质金属蛋白酶(MMPs)促进ECM的降解，当合成的ECM多于其降解，平衡受到破坏将会导致肝纤维化的发生〔4～6〕。抑制HSC的活化状态，减少ECM的沉积被认为是有效的逆转肝纤维化的一个方法〔7〕。中药抗纤软肝胶囊对肝纤维化具有较好的治疗作用，但其机制仍需进一步研究。本文通过检测反映肝纤维化程度的血清学指标透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ-C型胶原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)和血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)的表达水平，观察抗纤软肝胶囊能否逆转四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化，并探讨抗纤软肝胶囊对HSC活化与凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及大鼠细胞：HSC-T6为永生化的大鼠HSC，该细胞系几乎保留活化HSC的所有功能，α-SMA表达阳性，本文以传代12代以内用作实验。试剂：RPMI-1640和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCl4购自南京博全科技有限公司；抗纤软肝胶囊含丹参、赤芍、川穹、柴胡、冬虫夏草、生牡蛎、鳖甲等七味中药，由本院自制；RNA逆转录试剂盒购自美国Promega公司；Real Time-PCR试剂(SYBR Green Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD公司；大鼠血清ALT、AST和ALB等生化指标用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪检测，大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自南京安培化工科技有限公司，用Biotek ELX800酶标仪检测。大鼠：清洁级雄性SD大鼠32只，购自南京医科大学动物实验中心(NMXK)，体重(185±15)g。遵循南京医科大学生物医学研究伦理委员会的伦理学标准开展试验。

1.2 试验方法 (1)建立肝纤维化模型：采用随机数字表法分为正常对照组和肝纤维化建模组各16只，建模组大鼠皮下注射1 ml/kg 50% 的CCl4植物油溶液，注射2次/w，持续8 w，制成大鼠肝纤维化模型。正常对照组以同样方法注射等量植物油。(2)分组：正常对照组随机分为正常组8只，药物组8只，建模组随机分为模型组 8只，治疗组8只。药物组采用抗纤软肝胶囊(包括茵陈蒿20 g，丹参30 g，鳖甲10 g，三七6 g，桃仁10 g，当归10 g，莪术10 g，炮山甲6 g，土鳖虫10 g，白术10 g，薏苡仁20 g，黄芪10 g)2 g/kg溶于生理盐水中灌服正常大鼠；治疗组在造模同时给予抗纤软肝胶囊，每次剂量为2 g/kg溶于生理盐水中灌服，灌胃2次/w，1 ml/kg，其他组同期灌服相当量的生理盐水溶液。(3)病理组织学检查：实验进行8 w末处死各组大鼠，取肝脏组织，10%甲醛固定，行苏木素-伊红(HE)染色，并观察各组肝组织的病理学改变；同时进行Masson染色(丽春红酸性品红液、苯胺蓝液、亮绿液三色染色)观察胶原纤维增生程度。(4)血清样本测定：同时取下腔静脉血液，分离血清样本。全自动生化分析仪检测大鼠血清中ALT、AST和ALB等生化指标，同时ELISA法测定大鼠血清中HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ水平。(5)药物血清的制备：将上述分离的各组大鼠血清同组混合，于56℃热灭活30 min，过滤除菌，加入RPMI-1640培养液，配制成10%的培养基。然后将HSC-T6以1×105密度接种于6孔板，每组3复孔，同时用无血清的RPMI-1640饥饿培养24 h，使细胞周期同步于G0期。 24 h后用上述4种血清继续培养18 h，分别收取细胞用于提取RNA和细胞凋亡检测。(6)Real Time-PCR法：用Trizol收取上述4组不同处理的血清培养的HSC-T6，用氯仿抽提法得细胞RNA，经逆转录得cDNA，应用罗氏荧光定量PCR Lightcycler 480采用三步法进行定量检测实验，反应条件第一步预变性95℃ 5 min，第二步循环反应(设置40个循环数)95℃ 10 s，60℃ 30 s，溶解曲线95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，统计结果以2-ΔΔCt表示。β-actin上游引物：ACCCACACTGTGCCCATCTAT，下游引物：AGAGTACTTGCGCTCAGGAGGA；α-SMA上游引物：CCGAGATCTCACCGACTACC，下游引物：TCCAGAGCGACATAGCACAG；TGF-β1上游引物：TGGAGCAACACGTAGAACTCTACC，下游引物：ACTGCCGGACAACTCCAGTG。(7)流式细胞仪检测细胞凋亡：上述4组细胞分别用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂标记后用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏病理学改变 HE染色：正常组与药物组肝组织结构正常；而模型组可观察到明显的小叶中心坏死，显著的脂肪变性，大量的胶原纤维沉积；治疗组小叶中心坏死减轻，脂肪变性与胶原沉积相对于模型组都有显著的改善。Masson染色：正常组与药物组胶原纤维正常分布；而模型组Masson染色显示有过多的胶原沉积，纤维桥和假小叶形成；治疗组染色结果显示相对于模型组沉积的胶原明显减少。见图1。

图1 大鼠肝脏组织的HE染色和Masson染色(×100)

2.2 各组大鼠血清肝功能指标的变化 4组大鼠血清肝功能指标整体分析差异均有统计学意义(F=65.351，87.430，14.888，均P=0.000)。与正常组和药物组比较，模型组和治疗组ALT和AST水平均明显升高(均P<0.05)，而与模型组比较，治疗组ALT和AST水平均明显降低，ALB显著增加(均P<0.05)。见表1。

组别ALT(U/L)AST(U/L)ALB(g/L)正常组40.1±10.493.6±21.228.9±2.3药物组38.8±9.498.4±17.530.7±2.9模型组257.0±67.51)2)534.1±110.11)2)24.1±1.41)2)治疗组101.3±20.21)2)3)247.0±52.31)2)3)28.2±1.02)3)

与正常组比较:1)P<0.05；与药物组比较:2)P<0.05；与模型组比较:3)P<0.05;下表同

2.3 各组大鼠血清肝纤维化4项指标的变化 4组血清肝纤维化4项指标的整体分析差异均有统计学意义(F=85.425，15.395，53.289，93.341，均P=0.000)。与正常组和药物组比较，模型组和治疗组血清HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ水平显著增加(均P<0.05)；而与模型组比较，治疗组上述指标均显著减少(均P<0.05)。见表2。

组别HA(ng/ml)LN(ng/ml)IV-C(μg/L)PC-III(μg/L)正常组98.9±17.197.9±13.438.1±8.790.5±18.9药物组100.3±16.8100.2±15.040.3±6.792.7±17.3模型组278.7±40.11)2)139.8±14.01)2)98.3±16.01)2)247.7±35.11)2)治疗组200.0±25.31)2)3)112.8±13.01)2)3)65.9±9.91)2)3)170.4±23.61)2)3)

2.4 抗纤软肝胶囊对HSC-T6活化的影响药物组(0.71±0.11，0.56±0.12)与正常组(0.92±0.13,1.56±0.34)相比，α-SMA和TGF-β1 mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)，治疗组(1.36±0.41,1.87±0.61)与模型组(3.25±0.87,4.22±1.15)相比表达水平也降低(P<0.05)。

2.5 抗纤软肝胶囊对HSC-T6凋亡的影响药物组HSC-T6细胞早期凋亡〔(19.23±2.67)%〕和总凋亡水平〔(23.69±3.03)%〕明显高于正常组〔(7.90±2.16)，(8.63±1.12)%〕(P<0.05)，治疗组〔(12.35±1.69)%,(17.39±2.54)%〕也显著高于模型组〔(3.44±0.56)%,(5.53±1.05)%〕(P<0.05)。

3 讨论

肝纤维化是机体对各种致病因素引起的慢性肝损伤产生的一种损伤修复反应，尽管早期的肝纤维化临床症状不明显，但当肝脏受到持续的损伤时，肝纤维化可发展成肝硬化直至原发性肝癌，可出现门静脉高压、腹水、肝性脑病和代谢功能障碍等。然而，关于肝纤维化目前却没有有效标准治疗方案，对其治疗主要从减少肝损伤方面采取干预措施，但是并不能彻底治愈肝纤维化，因此有效的抗肝纤维化药物十分必要〔8〕。其中HSC的激活是肝纤维化过程中一个关键的环节，在正常肝脏中，HSC主要的功能是存储维生素A；然而，当肝脏受到损伤，HSC活化，从而产生过多的胶原沉积，最终导致肝纤维化。所以，诱导HSC凋亡可能有助于纤维化的终止〔9，10〕。因此，抑制HSC的活化过程、促进HSC的凋亡是防治肝纤维化的关键。

本研究结果提示抗纤软肝胶囊可以明显减轻甚至逆转肝纤维化，而且抑制HSC的激活过程可能是抗纤软肝胶囊减轻肝纤维化的一个机制。另外，由于HSC在肝纤维化过程中发挥重要的作用，因此，诱导活化的HSC凋亡被认为是减轻或者降低肝纤维化的方法〔11，12〕。本文发现，抗纤软肝胶囊可以促进HSC-T6的凋亡过程。因此，抗纤软肝胶囊另一方面是通过促进HSC凋亡实现减轻肝纤维化的目的。肝纤维化的治疗一般是作用于肝纤维化的不同过程，尤其是其中激活HSC的环节，而抗纤软肝胶囊明显抑制活化的HSC表达α-SMA和TGF-β1，同时促进活化的HSC凋亡，从根本上减少ECM的沉积，逆转肝纤维化过程。抗纤软肝胶囊中的成分如丹参、冬虫夏草、鳖甲等能促进ECM中胶原的降解，而丹参、柴胡和赤草还能起到保护肝细胞的功能、促进肝细胞的再生，从而间接阻止肝纤维化进展的作用。另外，中药的药材取自天然，减少了化学合成药物的毒副作用，且中药的治疗强调“君臣佐使”，各成分之间相互制约又相互补充，协调作用，形成一股强大的药力，临床疗效十分显著。

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〔2016-11-07修回〕

(编辑滕欣航)

湖北省自然科学基金(No.2016CFB638)；湖北省卫生厅科研基金项目(No.JX5B39)

1 湖北省中山医院肝病科

张建军(1964-)，男，博士，主任医师，主要从事中西医结合肝病方面的研究。

刘黎明(1981-)，男，在读博士，主治医师，主要从事中西医结合肝病方面的研究。