禽流感病毒（H9亚型）LN株的分离鉴定及生物学特性研究

2017-04-19王志国辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心

兽医导刊 2017年7期

王志国/辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心

王志国/辽宁省北镇市动物疫病预防控制中心

禽流行性感冒(简称禽流感，Avain Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类(包括家禽和野禽)的感染疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。

2010年，笔者于辽宁某市某养殖场的发病鸡群中分离到一株禽流感病毒，经鉴定为H9N2亚型禽流感，命名为LN株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性。为了评价MDCK细胞高适应的禽流感疫苗株LN的生物学特性和免疫效果，我们进行了一系列的试验研究。

一、试验方法

（一）病毒的分离

2010年，从辽宁省某养鸡地区的疑似H9N2禽流感发病鸡群中，无菌采取具有典型临床症状病鸡的肺脏和肝脏等剪碎，按1∶5（W/V）加入灭菌生理盐水后，研钵研磨后-40℃到室温冻融3次，经3 000 r/min离心15 min取上清液备用。

将上述病料上清液通过0.22μm微孔滤器除菌，尿囊腔接种10日龄非免疫鸡胚。每份病料接种8枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 ml，同时作不接种对照，37℃孵育。弃去24 h内死胚，无菌收集48 h的鸡胚尿囊液，-40℃保存备用。

病毒分离后需要在SPF鸡胚上进行3次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有血凝价鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒，如此经三次纯化后，以10-3稀释接种9～11日龄SPF胚，48小时后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。

（二）血清学及RT-PCR鉴定

将无菌收集的鸡胚尿囊液以1.0%鸡红细胞悬液采用β微量法进行HA试验，以HA价≥3 log2为试验阳性。对有直接血凝性的样本进行H9亚型AIV HI（血凝抑制试验）与NI（神经氨酸酶抑制试验）。

根据GenBank已发表的H9N2毒株的HA基因序列，用Primer 5.0软件设计了一对H9N2 HA基因的特异性引物，用于HA基因部分序列的扩增。预期扩增产物片段长度为753 bp。引物的序列如下：上游引物(18个碱基)：5′-AATGGTCCTACATCGTCG-3′；下游引物(18个碱基)：5′-TGGCTCCAAATAGTCCTC-3′，以上引物由上海生物工程有限公司合成。

（三）分离毒在MDCK细胞中的增殖

将纯化的组织毒，用灭菌生理盐水稀释后，接种90%长成单层后的MDCK细胞，37℃培养48～72 h，病变达75%以上放入-70℃中反复冻融3次，收获病毒液。传代10次，直至病毒在MDCK细胞增值良好。

（四）分离病毒LN株致病性的测定

通过鸡胚半数感染量(EID50)、半数组织感染量(TCID50)和静脉接种指数(IVPI)试验来检测分离病毒LN株的致病性，试验中对细胞毒和胚毒进行了同步试验，以比较不同培养方式繁殖的病毒液在毒力方面的差异，试验方法如下。

1.病毒EID50测定。

将分离病毒用灭菌生理盐水作10-1～10-9稀释，并设立空白对照组，每个稀释度接种5枚10日龄非免疫鸡胚，弃24 h死亡胚，于接种后72 h 4℃过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液，测定其HA效价，并参考Reed-Muench方法计算出病毒EID50。

根据EID50结果，将LN株以l×107EID50剂量接种0.lml/胚，35℃温箱孵育，详细记录鸡胚死亡情况，以评定分离病毒LN株对鸡胚的致病性。

2.病毒TCID50测定。

（1）将状态良好的MDCK细胞以2～3×105个/孔接种96孔细胞培养板，置37 C，6% CO2培养箱培养12～24 h。

（2）用超纯水配制的无菌PBS(pH7.2)将病毒液进行10倍梯度稀释，设置10-3～10-108个稀释梯度。

（3）弃去培养基，用无菌PBS洗涤已培养成单层的MDCK细胞三遍，以去除培养基中的血清成分，避免血清对病毒吸附的影响。

（4）将每个稀释度的病毒接种于MDCK细胞，每个稀释度接种8孔，100μL/孔，37℃吸附1h左右。

（5）弃去吸附液，用灭菌PBS洗涤MDCK细胞一遍，加入含终浓度2μg/ml的TPCK-trypsin的细胞维持液(无抗无血清的DMEM培养基置35℃，6%CO2培养箱培养，每隔12 h观察1次。

（6）待到细胞病变(CPE)和HA效价不再发生变化时，用Reed-Muench公式计算TCID50。

3.静脉接种致病指数(IVPI)的测定。取6周龄非免疫鸡8只，按中华人民共和国兽用生物制品质量标准的方法测定IVPI。引起禽流感的A型流感病毒对6周龄鸡的静脉致病指数(IVPI)大于1.2或感染的A型流感病毒H5或H7亚型的核苷酸序列在血凝素的裂解位点上有多个碱性氨基酸，即确定为高致病性禽流感病毒。

（五）禽流感H9N2亚型LN株免疫保护试验

为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，根据试验中测得的数据，通过用空白尿囊液稀释的方法，将经MDCK细胞和鸡胚扩增的两种病毒液调整为具有相同HA效价、EID50和TCID50的三组病毒液，并分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量后，观察免疫及保护效果。

1.实验动物分组。

NC/NE—表示未经稀释的原始细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组。

HC/HE—表示经稀释得到的具有相同HA效价的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组。

EC/EE—表示经稀释得到的具有相同EID50的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组。

TC/TE—表示经稀释得到的具有相同TCID50的细胞毒和胚毒制备疫苗免疫组。

每组14只SPF鸡，同时留5只不免疫作为攻毒对照组。

2.免疫及攻毒。所有试验SPF鸡于负压隔离器内饲养至4周龄进行免疫，免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。灭活疫苗按每只0.3 ml的剂量经胸部肌肉接种免疫。首免后第7、14、21天采血，用商品化标准抗原检测抗体效价。免疫后4周4周后，用分离病毒LN株尿囊液做攻毒试验。攻毒剂量均为105.0EID50，每只鸡100μL。毒后的第3，5，7天分别采取咽喉和泄殖腔拭子，进行病毒分离检测，取处理后的样本上清以尿囊腔途径接种SPF鸡胚，收集死亡鸡胚的尿囊液进行HA效价检测，当HA效价达4 1og2以上时，确定病毒分离为阳性。

二、结果

（一）病毒分离

病料经过4代鸡胚培养后，HA血凝价逐渐稳定，鸡胚死亡数开始增长，胚体病变逐渐明显。种毒经适当稀释后，接种SPF鸡胚尿囊腔，收集接种后48～72 h鸡胚的尿囊液，经离心纯化后，-70℃保存备用。

（二）HI及NI试验结果

取病毒分离为阳性的尿囊液，用ND、IB、IBD及EDS-76抗血清进行HI试验，不产生抑制现象，表明分离株并非上述病毒株，结果只能被H9 AIV阳性血清所抑制。神经氨酸酶抑制试验检测，该病毒只能被N2亚型阳性血清特异性抑制，因此，鉴定结果为H9N2亚型禽流感病毒，并命名为A/Chicken/Jilin/LN（缩写为LN）。

用H9N2 AIV HA基因的特异性引物对该毒株的鸡胚尿囊液进行RT-PCR扩增，也得到753 bp的目的基因片段(图1)，与预期结果相符。

图1 吉林市分离株HA基因的RT-PCR扩增结果

（三）分离病毒LN的致病性测定

分离病毒LN株接种10只10日龄SPF鸡胚后，24 h内无鸡胚死亡。在36～96 h孵育期间致死4枚鸡胚，死亡率40%。

表1 分离病毒LN株致病性测定

（四）禽流感H9N2亚型LN株免疫保护试验

在本试验中，我们将分离病毒LN株油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡，并排除了免疫时抗原量对各组免疫保护效果的影响，在免疫后1周鸡群就可检测到低水平的HI抗体水平，免疫后2周免疫组所有鸡群都产生明显的抗体，平均HI抗体水平达6 1og2，免疫后3周各试验组的HI抗体水平达到高峰，平均效价达7 1og2以上（见表2），表明分离病毒LN株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平，且从抗体检测结果可以看出在各个时间点细胞上清免疫组的抗体水平均要比尿囊液免疫组高，抗体水平上升也较快。