单增李斯特菌的快速检测方法研究进展

李波+赵文胜++王国柱++冯冠++吴文浩++王丹丹

摘要 单增李斯特菌是一种重要的人兽共患病病原体，其检测已成为食源性疾病预防与控制的重点内容。单增李斯特菌快速检测技术的研究对我国食品安全工作具有极其重要的意义。本文对国内外单增李斯特菌的多种快速检测方法及其检出限进行对比，探讨了快速检测单增李斯特菌在未来的发展方向。

关键词 李斯特菌；快速检测；分子检测

中图分类号 S852.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）24-0265-03

Research Progress on Rapid Detection and Identification Methods for Listeria Monocytogenes

LI Bo 1，2 ZHAO Wen-sheng 1 WANG Guo-zhu 1 FENG Guan 1 WU Wen-hao 1 WANG Dan-dan 1，2

（1 Yanjiao Office of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yanjiao Hebei 065201； 2 Yanjiao Branch Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Inspection and Quarantine Technical Center）

Abstract Listeria monocytogenes is a kind of facultative pathogens of human and animal，its detection and identification has become the focus of prevention and control of food borne diseases.In this paper，rapid detection methods and detection limit of Listeria monocytogenes at home and abroad were compared，and the future development direction of the rapid detection of Listeria monocytogenes was discussed.

Key words Listeria monocytogenes；rapid detection；molecular detection

单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种重要的人兽共患病病原体，也是一种最为常见的食源性病原菌，WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。单增李斯特氏菌广泛存在于肉制品、乳制品、水产品以及土壤中，4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[1]。随着生活节奏的加快，快餐食品逐渐受到我国人们的欢迎，单增李斯特菌的危害也随之而来，因此对李斯特菌的检测工作尤为重要。传统的李斯特菌检测方法繁琐，耗时长，灵敏度低，难以满足市场需求。发展快速准确、操作简便的检测与鉴定单增李斯特氏菌的方法对于提高食品卫生水平、保证食品安全具有重要的意义。

目前，单增李斯特菌的检测方法中较常用的还是国标法[2]。随着食品检测技术的持续发展，高灵敏度的单增李斯特菌的快速检测方法不断完善，国内外对李斯特菌的快速检测技术有了突飞猛进的发展，主要分为免疫学检测、分子生物学检测，生物传感器，自动化检测及联合检测方法。快速检测方法大大提高了检测的灵敏度，缩短了检测时间，成为未来食品检测主要的发展方向。

1 免疫学检测

免疫学检测法是利用抗体与抗原特异性结合的原理进行检测的方法，抗体与检测方法的不同，直接影响了单增李斯特菌的检测限。主要的检测方法有酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶联荧光分析法（ELFA）和免疫磁性分析（IMS）等[3]。

1.1 ELISA法

ELISA法是抗原或抗体与酶形成的酶结合物与底物反应，催化生成带色产物，根据颜色深浅进行定性定量的检测方法。应用于食品安全检测的ELISA试验不断创新，Bhunia等建立的夹心ELISA法在20～24 h检出限为8～10 cfu/g（mL）[4]。赵 丽等[5]采用单增李斯特菌液相芯片，利用微球偶联结合双抗夹心技术测定偶联率，检测限为103 cfu/mL。現在已有德国拜发公司生产的商品化的单增李斯特菌检测试剂盒可供使用，用ELISA方法操作较简单，特异性强，反应灵敏度高，但由于单克隆抗体制备昂贵，所以用ELISA盒进行多种食品样品的检测费用较高。

1.2 ELFA检测法

ELFA法将荧光标记物添加到抗体上，通过测定荧光强度检测单增李斯特菌的数量，大大提高了检测的灵敏度。Jaakohuhta 等[6]利用时间分辨荧光免疫分析法进行污染食品检测，用时16 h，灵敏度为20 cfu/mL。Shi L等[7]运用测流免疫层析法20 min内检出限为104 cfu/mL，特异性良好。免疫层析试纸条法方法方便，但存在一定的漏检率，稳定性有待进一步提高。

1.3 IMS检测

IMS依据抗原抗体原理，通过磁珠的富集缩短增菌时间，降低单增李斯特菌的检测限。免疫磁珠检测方法可快速特异地检测出食品中单增李斯特菌，具有高灵敏度[8]。免疫磁性分离IMBS与PCR和ICG结合方法15 h测得检出限为100 cfu/mL[9]。免疫磁珠-选择性培养基检测法9 h牛奶样品检测限为0.4 cfu/mL[10]。纳米磁珠低场磁共振技术的线性检测范围为 1～103 cfu/mL[11]。超顺磁免疫层析技术现已在临床诊断、食品检验等领域得到广泛应用，已有104 cfu/mL的灵敏度[12]。目前Matrix生产的Pathatrix快速检测系统属于世界最快的检测方法之一[13]。磁珠的立体结构扩大了反应面，促使IMS受到各检测领域的广泛关注，但灵敏度还需进一步提高。

免疫学检测方法具有良好的特异性和重复性，可同时对多个样品进行检测，实现检测自动化，单一的免疫学检测方法稳定性较差，与免疫学相结合的检测方法有待进一步开发研究。

2 分子生物学检测

由于分子生物学理论和技术的不断发展与成熟，相关的分子生物学检测方法如PCR技术、核酸探针杂交技术、实时荧光PCR（Real time-PCR）、多重PCR（M-PCR）及基因芯片等新型技术在单增李斯特菌的检测研究中得到广泛应用。

2.1 PCR技术

PCR检测是较为传统的分子生物学技术，通过设计特异毒力基因和特异性序列的引物，完成单增李斯特菌的检测工作。常用的几种靶基因包括hlyA[14]、iap[15]、inlB[16]、inlA[17]，可对多类食品进行单增李斯特菌的检测工作。

在PCR基础上运用新的检测技术，可提高检测效率，缩短检测时间。Uyttendaele等[18]以16s rRNA为靶基因设计引物，利用核酸序列扩增（NASBA）技术对李斯特菌属进行检测，具有较高的特异性。有研究者利用环介导恒温扩增（LAMP）检测技术[19]对肉制品进行检测。三重LAMP检测法可在90 min内完成检测，灵敏度为10 fg/μL[20] 。随着技术的不断发展，与PCR结合的新技术在检测灵敏度上获得进一步的突破。

2.2 核酸探针杂交技术

核酸探针杂交技术最早作为分子生物技术应用于单增李斯特菌检测[21]，通过设计特异性探针，以同位素标记的方式，根据DNA杂交原理，检测李斯特菌。Volokhov等以李斯特的6种毒力蛋白基因为靶基因设计多重PCR，研制出了基因芯片检测单增李斯特菌，可达到种的水平[22]。通过寡核苷酸探针合成[23]、探针标记、微孔板杂交技术[24]等方法，可提高检测效率，但由于探针制备工作复杂，检测灵敏度有待提高，在实际工作中未得到广泛运用。

2.3 Real time-PCR

Real time-PCR是在PCR扩增体系中加入荧光标记，根据荧光强度达到定量检测的目的，特异性强，灵敏度高，简单快捷。Real time-PCR技术可在3 h内完成乳制品中单增李斯特菌的检测，檢测限为660 cfu/mL[25-26]。Rossmanith 等[27]对人工污染的牛奶和三文鱼、鹅肝酱、奶酪样品中单增李斯特菌（prfA）进行Q-PCR检测，检测限分别为0.3 cfu/mL和 0.07～0.60 cfu/g。闫 琳等[28]与 Rodriquez-Lazaro 等[29]对肉制品和蔬菜等进行荧光定量PCR检测，结果相似。许华青等[30]对模拟粪便标本进行双重Real-time PCR检测，结果特异性良好，单增李斯特菌检测下限为2.45 ×103 cfu/g。有不少研究者通过建立多重Real time-PCR方法检测海产品等样品中单增李斯特菌含量，可达6.5 cfu/mL灵敏度，稳定性强[31-32]。刘二龙等[33]设计hlyA、inlA 和plcB探针建立的TaqMan-MGB三重Real time-PCR 检测方法，可将变异系数控制到1.5%以内，灵敏度可达100 cfu/mL。SureTect 实时PCR检测方法测得相对检测限在0.02～0.06 cfu/g的样品，具有较高稳定性和特异性[34]。实时荧光定量PCR对引物和探针有严格的要求，需要特定的仪器进行实验操作，在基层实验的应用上存在一定的限制。

2.4 M-PCR检测

M-PCR可以同时扩增多个靶基因，从而检测出食品中的多种致病菌。胡冰雪等[35]根据荧光假单胞菌的gyrB基因、沙门氏菌的invA基因和单增李斯特菌的hlyA基因，定量检测肉制品中3种致病菌情况，M-PCR检测灵敏度分别为9、5、70 cfu/mL。Germini等[36]使用M-PCR检测液体状态蛋样品中的单增李斯特菌（prfA基因）、沙门氏菌、大肠杆菌，在经过15 h增菌后检测限为0.4 cfu/g。钱云开等[37]利用单增李斯特菌4个毒力基因（hly、prfA、inlA、inlB）引物，通过多重PCR 扩增，经变性高效液相色谱（DHPLC）进行快速检测，具有良好的特异性，灵敏度可达到280 cfu/mL。多重PCR检测技术可同时实现多菌的检测特点，使得在引物设计工作中难度增大，退火温度和产物片段等要求需同时顾及，需要多次进行条件优化才能得到实施。

综上所述，分子生物学检测方法具有高灵敏度、特异性强、速度快的特点，大大提高了食品检测效率，在单增李斯特菌的检测工作中占有重要地位（表1）。但分子生物学检测技术无法分辨死菌和活菌，引物要求严格，反应条件的优化直接影响灵敏度和特异性。

3 全自动微生物检测

微生物鉴定、酶联免疫学、分子生物学检测已出现自动化分析系统，如法国的VITEK系列全自动微生物分析系统、杜邦的BAX系统、美国的GDS系统[38]。陈 敏等[39]通过mini VIDAS 及 VITEK-AMS全自动微生物生化鉴定系统检测单增李斯特菌，4 d检测限达10 cfu/mL。杜邦的Ribo Printer系统是现在唯一可以对所有微生物种类进行快速鉴定和分型溯源的全自动微生物基因指纹鉴定系统，检测工作仅需8 h。随着食品检测市场需求的不断发展，全自动化检测系统必然成为全球的研究热点。

4 联合方法检测

多种检测方法联合检测致病菌，可弥补单一检测方法的不足，提高检测的灵敏度和特异性。IMS与RT-PCR联用3.5 h测鱼中单增李斯特菌检出限为10～40 cfu/g[40]。张 赛等[41]通过免疫磁珠与荧光免疫层析相结合的方法，检测人工污染样品和纯培养的单增李斯特菌，检测限为1～4×104 cfu/mL，相对于荧光免疫层析试纸条灵敏度提高了10倍。联合检测体系具有较高稳定性和特异性，免疫磁珠与PCR技术相结合，为菌体富集和致病菌检测提供新思路。

5 生物传感器

生物传感器是通过待测物与分子识别元件结合后产生的复合物输出的电和光信号进行分析检测。信号转换器的不同，可将生物传感器分为电化学式生物传感器、光学式生物传感器等。Radhakrishnan 等[42]用交流阻抗法结合单抗检出番茄样品中单增李斯特菌检测限为4 cfu/mL。BIAcore-3000 生物传感器[43] 可在30 min 内完成单增李斯特菌检测工作。Davis 等[44]用丝网印刷碳电极条作一次性安培传感器，1 h 内检测出蓝莓样品中的单增李斯特菌，检测限为 102 cfu/g。石英晶体微天平[45]快速检测李斯特菌检测限为107 cells/mL，可多次重复使用。悬臂梁压电生物传感器结合单增李斯特菌多克隆抗体[46]进行牛奶样品检测，1 h内可测得样品检测限为102 cells/mL。刘金华等[47]应用光纤倏逝波生物传感器检测单增李斯特菌，灵敏度达30 cfu/mL。Paul 等制备的表面等离子体免疫传感器，检测食品中的单增李斯特菌检测限为 105 cfu/mL[48]。生物传感器检测方法可将检测时间缩短到24 h 以内，但是测得的样品检测限较高，具有高灵敏度的生物传感器有待开发研究。

6 结语

食品工业的快速发展要求食品检测技术与时俱进，但目前应用于食品工业检测的方法并不多，且存在很多不足，无法满足市场需求。致病菌的检测技术主要围绕检测时间、检出限、特异性进行评价，目前免疫学方法和分子生物学方法是李斯特菌检测的重要发展方向，但不同的检测方法存在一定的缺陷，如何在保证特异性和稳定性的基础上加快检测时间，提高灵敏度，降低检测限应成为所有研究人员重点考虑的问题。在免疫检测或PCR技术的基础上，运用其他检测技术，可明显提高检测灵敏度，降低检测限，缩短检测时间，增强特异性。因此，联合检测技术将成为单增李斯特菌的重要发展方向。基于食品行业发展现状，快速检测技术还需标准化之后进行广泛推广应用，才能促进食品检测行业的平稳发展[49-54]。

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