香叶木素的检测方法与生物活性及其机制研究进展

杨蕾磊，陈科力（1.湖北中医药大学药学院2014级，武汉 430065；2.教育部中药资源和中药复方重点实验室/湖北中医药大学药学院，武汉 430065）

香叶木素的检测方法与生物活性及其机制研究进展

杨蕾磊1＊，陈科力2#（1.湖北中医药大学药学院2014级，武汉 430065；2.教育部中药资源和中药复方重点实验室/湖北中医药大学药学院，武汉 430065）

目的：为香叶木素的研究与开发提供参考。方法：以“香叶木素”“生物活性”“Diosmetin”“Bioactivity”等为关键词，组合查询2000年1月－2016年3月在PubMed、中国知网、万方、维普等数据库中的相关文献，对香叶木素的检测方法和生物活性及其机制进行综述。结果与结论：共检索到相关文献50篇，其中有效文献24篇。香叶木素可采用毛细管电泳-电化学法、化学发光法、高效液相色谱法等方法进行检测，其具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤及雌激素样作用。在信号通路、基因和相关蛋白酶的调控方面的研究，为香叶木素作为新型高效、低毒的抗癌辅助药物开发提供了可能。建议加强香叶木素提取工艺、体内药效学和提高生物利用度的药剂学研究，并对其用药安全性进行考察。

香叶木素；黄酮类化合物；生物活性；检测方法

香叶木素是天然黄酮类化合物的一种，化学名称为3′，5，7-三羟基-4′-甲氧基黄酮。香叶木素为黄色粉末，熔点为256～258℃，分子式为C16H12O6，分子量为300.26。可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。结构式中3′，5，7这3个位置的羟基和C2＝C3双键决定了香叶木素独特的化学性质和生物学活性，其中7位酚羟基可与不同的糖基结合发生糖苷化反应而表现出不同的生物学活性。香叶木素在自然界中分布广泛，主要以游离型或糖苷型存在，目前发现主要存在于菊花[1-2]、留兰香[3]、蜘蛛香[4]等天然药物和柠檬[5]、花生[6]等果实中。由于黄酮类化合物是人们日常饮食的重要组成部分，且近年来饮食中的黄酮类化合物对癌症的化学预防作用是国内外学者研究的热点，因此笔者以“香叶木素”“生物活性”“Diosmetin”“Bioactivity”等为关键词，组合查询2000年1月－2016年3月在PubMed、中国知网、万方、维普等数据库中的相关文献。结果，共检索到相关文献50篇，其中有效文献24篇。现对香叶木素的检测方法和生物活性及其机制进行综述，以期为其研究与开发提供参考。

1 香叶木素的检测方法

香叶木素可采用毛细管电泳-电化学法、化学发光法、高效液相色谱法等方法进行检测。

1.1 毛细管电泳-电化学法

毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、样品和试剂用量少、重现性好等优点，是一种高效的分离分析技术。对于电活性物质的检测，毛细管电泳与电化学检测联用，具有更高的灵敏度和选择性。傅亮等[7]采用毛细管电泳-电化学法分别测定不同产地蜘蛛香根中香叶木素、山柰酚、芹菜素、绿原酸以及咖啡酸等5种多元酚类化合物的含量。采用300 μm的碳圆盘电极为工作电极，检测电位为+950 mV（vs.SCE），在50 mmol/L的硼砂缓冲溶液（pH＝9.23）中，上述各组分在23 min内能完全分离。

1.2 化学发光法

化学发光是指在化学反应的过程中，物质分子吸收化学能后产生光辐射的现象。化学发光法是利用反应体系中的待测物质与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性关系的原理，通过仪器检测体系的化学发光强度，从而确定待测物含量的一种方法。李丽等[8]研究发现，香叶木素对高锰酸钾（KMnO4）氧化碱性鲁米诺（Luminol）的化学发光反应有非常明显的增敏作用。除香叶木素外，纳米银（AgNPs）也对Luminol-KMnO4-NaOH体系的发光强度有增敏作用，但在AgNPs和香叶木素共同存在的条件下，此体系的发光强度可增加4倍多且发光速度加快，检测香叶木素的灵敏度更高[4]。除此之外，香叶木素对铁氰化钾{K3[Fe（CN）6]}氧化碱性Luminol的化学反应也有较强的增敏作用。李丽等[9]的试验结果表明，香叶木素加入K3[Fe（CN）6]和碱性Luminol的混合溶液中之后，在更短的时间内，体系的发光强度增大了1倍多。

3种反应体系测定香叶木素的线性范围、检出限和相对标准偏差（RSD）比较见表1。综合3种反应体系，Luminol-NaOH-KMnO4-AgNPs体系的抗干扰能力最强，其RSD最小。若待测定样品中香叶木素的含量较低，可考虑使用Luminol-KMnO4-NaOH体系进行检测，此体系具有最低的检出限。

表1 3种化学发光法比较

1.3 高效液相色谱法

邓斌等[10]的研究表明，对于血浆中香叶木素含量的测定，可以采用高效液相色谱法。大鼠血浆与酶水解液（β-葡萄糖醛酸酶200 U/mL，硫酸酯酶10 U/mL）共同孵育16 h后，采用梯度洗脱方式进行分析，流动相为乙腈（A）-甲醇-0.2%磷酸溶液（50∶50，V/V，B）。结果，香叶木素在质量浓度为0.02～50 μg/mL时与色谱峰面积比之间的线性关系良好，加样回收率为76.1%～81.9%，精密度RSD为5.8%～11.9%。

植物性食物中的香叶木苷，在体内肠道菌群和消化酶的作用下，可水解为香叶木素。Kanaze FI等[11]采用高效液相色谱法对人血浆中的香叶木素进行分析，取血浆样品经液-液萃取后，用C8反相色谱柱进行分析，流动相为甲醇-水-醋酸（55∶43∶2，V/V/V）。结果，香叶木素质量浓度在10～300 ng/mL范围内有良好的线性关系，加样回收率为89.7%，精密度RSD为1.6%～5.3%。

Campanero MA等[12]使用C18反相色谱柱分析人血浆中的香叶木素。在pH值为2的条件下，用甲基叔丁基醚萃取血浆样品后注入液相色谱柱进行分析，以甲醇-1%甲酸（58∶42，V/V）为流动相。结果，香叶木素质量浓度在0.25～500 ng/mL范围内呈良好的线性关系，加样回收率为89.2%，精密度RSD为2.8%～12.5%。

黄酮苷的水解过程受到酸、碱和酶的影响。为了筛选出从菊花粉末中提取香叶木素、木犀草素和芹菜素的最优水解条件，Li FG等[13]采用4因素3水平的正交试验法对水解条件进行了优化，提取液中香叶木素、木犀草素和芹菜素的含量采用高效液相色谱法进行测定。以甲醇-0.25%磷酸（51∶49，V/V）为流动相，Zorbax SB-C18液相色谱柱为固定相，二极管阵列检测器用于检测。此方法精密度RSD为0.38%～2.0%，回收率为100.04%。

2 香叶木素的主要生物学活性及其机制

香叶木素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤及雌激素样作用，其机制涉及清除自由基、诱导细胞凋亡以及抑制细胞内信号的传递等。

2.1 抗氧化作用

阿尔茨海默病是老年人群中最常见的认知功能障碍疾病，过度产生并积累的β-淀粉样肽（Aβ）被认为是导致阿尔茨海默病的主要原因。晚期糖基化终末产物（AGEs）与Aβ之间有密切的相互作用，而AGEs及其受体利用细胞内的活性氧传递信号。Chandler D等[14]的研究表明，香叶木素具有清除这些活性氧的能力，可延缓AGEs及其受体的产生，因此被认为是一种天然的抗氧化剂。

卫强等[1]通过比较加入香叶木素前后含有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的95%乙醇溶液在517 nm波长下吸光度值的变化，对香叶木素的体外抗氧化活性进行考察。结果，加入香叶木素后，溶液吸光度值减小，说明香叶木素与DPPH·的单电子配对，溶液中的DPPH·浓度才降低，证明香叶木素具有清除DPPH·自由基能力，抗氧化活性较强。

采用邻苯三酚自氧化反应测定香叶木素对超氧阴离子自由基的清除作用。在碱性条件下，邻苯三酚自氧化生成有色中间物和超氧阴离子自由基。超氧阴离子自由基不仅是反应中间产物，还能加快反应进程。当反应体系中有抗氧化剂存在时，超氧阴离子自由基的含量降低，反应也受到抑制，有色中间物含量降低，溶液在322 nm波长处的吸光度值减小。邹淑君等[15]的试验结果显示，加入香叶木素后，在322 nm波长处吸光度值明显减小，说明香叶木素抑制了反应的进行，对超氧阴离子自由基有显著的清除能力，具有一定的抗氧化作用。

2.2 雌激素样作用

绝经妇女体内内源性雌激素分泌不足，将会导致骨质疏松、血液中胆固醇升高、更年期综合征等一系列疾病。人工合成的雌激素作为代替品对此类疾病有一定的预防和治疗效果。人乳腺癌细胞MCF-7是一种对雌激素敏感的乳腺癌细胞，细胞内的雌激素受体与具有雌激素活性的配体结合后，可诱发一系列激素依赖性的细胞内反应，最终反应为对细胞增殖的影响。Yoshikawa M等[16]采用人乳腺癌细胞MCF-7增敏试验对洋芫荽中分离出的黄酮类成分进行了体外雌激素检测，试验结果表明，香叶木素在一定浓度范围内对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有促进作用，半数效应浓度为2.9 μmol/L。

2.3 抗菌作用

肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的肺部感染性疾病，全球每年有几百万人死于肺结核，并且不断有新的感染者。如何提高肺结核的治愈率以及研发新的抗结核药物，已成为全球关注的健康问题。在菲律宾临床上常用一种名为毛鱼臭木的传统中草药来治疗肺结核。Lirio SB等[17]为了进一步研究毛鱼臭木用于治疗肺结核的物质基础，对毛鱼臭木甲醇提取物的体外抗菌活性进行了观察。通过比较香叶木素及其他提取物对结核分枝杆菌H37Rv菌株的最小抑菌浓度，可知毛鱼臭木内含有具有抗菌活性的化合物，这为毛鱼臭木用于肺结核治疗提供了理论依据。

为了研究香叶木素的体外抑菌活性，Meng JC等[18]选择了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉和红色毛癣菌，一共3种细菌和3种真菌作为实验菌种，进行了体外抑菌实验。结果表明，香叶木素在一定浓度下可以抑制枯草芽孢杆菌和红色毛癣菌的增殖，具有一定抗菌活性。

2.4 抗炎作用

许多疾病的形成与发展，都伴随有炎症现象的出现，比如动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。Mueller M等[19]为了探究日常饮食中的水果和蔬菜是否有助于降低炎症反应、起到预防炎症相关疾病的作用，对几种常见的从水果和蔬菜中分离得到的化合物进行了体外抗炎活性研究。结果显示，香叶木素具有降低促炎性白细胞介素6和肿瘤坏死因子α分泌的作用，表明其具有一定的体外抗炎活性。

佛波酯（TPA）诱导的小鼠耳肿胀模型，由于其造模方法简单、模型稳定，被广泛用于评价化合物的抗炎活性。TPA是巴豆油的主要活性成分，将其涂抹于小鼠耳朵局部，6 h左右即可出现明显的炎症反应。Domínguez M等[20]为探究香叶木素是否具有抗炎活性，将香叶木素用于TPA诱导的小鼠耳肿胀模型。结果，香叶木素对于小鼠耳肿胀具有明显的抑制作用，其半数有效量为每只耳0.45 mg，表明其具有较好的抗炎活性。

2.5 抗肿瘤作用

2.5.1 乳腺癌 乳腺癌和宫颈癌是妇科最常见的2种恶性肿瘤，其中乳腺癌发病率在我国女性人群中一直居高不下，且随着人们的健康意识逐渐增强以及我国医疗水平的提高，越来越多的早期乳腺癌患者被确诊并进行治疗，同时也发现乳腺癌发病人群呈现年轻化趋势。Wiseman M等[21]研究表明，遗传因素并不是导致癌症发生的主要因素，很大一部分癌症患者并没有肿瘤相关的家族病史，反而环境因素对肿瘤发病率的影响成为研究人员关注的热点。这也从另一个方面说明，在理论上，癌症是可以预防的。

Androutsopoulos VP等[22]以人乳腺癌细胞MDAMB-468和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A为细胞模型，采用MTT法和流式细胞术检测香叶木素对乳腺细胞生长的影响。结果，香叶木素能选择性抑制肿瘤细胞的生长，其对人乳腺癌细胞MDA-MB-468的半数抑制浓度（IC50）为4.5 μmol/L；而对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A的影响并不明显，IC50值为100 μmol/L。流式细胞术的试验结果也证实了香叶木素对乳腺癌肿瘤细胞的选择性作用：10 μmol/L的香叶木素作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-468 48 h之后，使用流式细胞术对其细胞周期进行检测，发现与正常对照组比较，有13.5%的细胞被阻滞在G1期；而相同浓度的香叶木素作用于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，并没有发现明显的细胞阻滞现象。

Androutsopoulos V等[23]选用人乳腺癌细胞MCF-7为细胞模型，通过MTT法对香叶木素的体外抗肿瘤活性进行研究。结果，香叶木素在一定浓度范围内可抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖，其IC50值为20 μmol/L。进一步研究发现，香叶木素的抗肿瘤活性与细胞色素P450酶介导的去甲基化反应有关。

2.5.2 肝癌 目前临床上主要采用化学疗法对肝癌患者进行治疗，但化疗药物在杀死癌细胞的同时也对宿主体内的正常细胞及免疫系统有一定的损害。癌症患者在治疗之后往往伴随有免疫力下降从而导致其他感染并发症。近年来，特异性和有效性已经成为抗肿瘤新药的研究热点。

Androutsopoulos VP等[24]研究了香叶木素对人肝癌细胞HepG2生长和增殖的影响，MTT试验结果表明香叶木素对人肝癌细胞HepG2有一定的生长抑制作用，能诱发细胞凋亡。流式细胞术和蛋白质印迹法的试验结果表明，加入香叶木素后，人肝癌细胞HepG2被阻滞在G2/M期；且伴随着细胞外信号调节激酶和c-Jun氨基端激酶蛋白表达量增加，肿瘤相关基因p53和p21表达得以增强。

3 结语

香叶木素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，广泛存在于植物界。在信号通路、基因和相关蛋白酶的调控方面的研究，为香叶木素作为新型高效、低毒的抗癌辅助药物开发提供了可能；同时，现有的各种检测方法又为其质量控制和药物代谢的研究提供了技术条件。但目前关于香叶木素的研究尚有以下不足：（1）需要加强提取工艺研究。虽然香叶木素在植物界分布广泛，且已有文献报道从植物类中药的树皮、叶、花和果实中提取分离出香叶木素，但天然香叶木素提取率并不高，体外合成途径的安全性也不理想，关于香叶木素工业化生产还处于“瓶颈”期。（2）虽然已有香叶木素抗乳腺癌和肝癌细胞系的基础实验，但还缺少香叶木素针对实验动物模型的在体研究。（3）缺少提高香叶木素生物利用度的药剂学研究以及相应的药动学研究。（4）香叶木素的毒性、安全剂量和不良反应等研究也不容忽视。

香叶木素作为日常饮食中容易获得的黄酮类化合物，具有巨大的生物学潜力和较好的开发前景。但当香叶木素主要以天然化合物的形式入药时，需要加强其提取工艺、体内药效学和提高生物利用度的药剂学研究，并对其用药安全性进行考察。

[1] 卫强，纪小影，龙先顺，等.滁菊叶化学成分及其体外抗氧化活性研究[J].中药材，2015，38（2）：305-310.

[2] 朱焕容，欧国灯，罗燕玉，等.中药材在清咽类保健食品中的应用及其功效成分研究进展[J].中国药房，2013，24（27）：2581-2583.

[3] 郑健，赵东升，吴斌，等.留兰香中化学成分的分离与鉴定[J].中国中药杂志，2002，27（10）：749-751.

[4] 李丽，周红暇，刘焱，等.纳米银参与的化学发光法测定蜘蛛香中的香叶木素[J].中国卫生检验杂志，2015，25（20）：3436-3439.

[5] 于玉涵，焦必宁.柠檬中类黄酮的含量分析和检测技术的研究进展[J].食品工业科技，2011，32（12）：518-523.

[6] 左爱学，孙赟，钱绍祥，等.花生壳化学成分研究[J].中药材，2015，38（2）：302-304.

[7] 傅亮，楚清脆，黄宝康，等.毛细管电泳-电化学检测法测定蜘蛛香中多元酚类化合物[J].分析化学，2005，33（2）：161-164.

[8] 李丽，冯琳，黎亮亮，等.KMnO4-鲁米诺-香叶木素化学发光体系的研究[J].分析试验室，2011，30（10）：68-70.

[9] 李丽，刘焱，盛永菊，等.流动注射-化学发光法测定香叶木素[J].理化检验（化学分册），2011，47（12）：1455-1457.

[10] 邓斌，韦炳华，黄盛超，等.HPLC法同时测定大鼠口服墨旱莲提取物后血浆中4种黄酮类化合物[J].中药材，2014，37（9）：1636-1640.

[11] Kanaze FI，Bounartzi MI，Niopas I.A validated HPLC determination of the flavone aglycone diosmetin in human plasma[J].Biomed Chromatogr，2004，18（10）：800-804.

[12] Campanero MA，Escolar M，Perez G，et al.Simultaneous determination of diosmin and diosmetin in human plasma by ion trap liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry：application to a clinical pharmacokinetic study[J].J Pharm Biomed Anal，2010，51（4）：875-881.

[13] Li FG，Zhou H，Sun DL，et al.An efficient method for the simultaneous determination of three flavone aglycones in Flos Chrysanthemi by acid hydrolysis and HPLC[J].J PHARM SCI-US，2009，1（18）：55-60.

[14] Chandler D，Woldu A，Rahmadi A，et al.Effects of plantderived polyphenols on TNF-α and nitric oxide production induced by advanced glycation endproducts[J].Mol Nutr Food Res，2010，54（Suppl 2）：141-150.

[15] 邹淑君，许树军，付起风，等.3种黄酮清除自由基活性的研究[J].化学工程师，2015，29（5）：4-7.

[16] Yoshikawa M，Uemura T，Shimoda H，et al.Medicinal foodstuffs：Ⅹ Ⅷ：phytoestrogens from the aerial part of Petroselinum crispum Mill.（Parsley）and structures of 6″-acetylapiin and a new monoterpene glycoside，petroside[J].Chem Pharm Bull，2000，48（7）：1039-1044.

[17] Lirio SB，Macabeo AP，Paragas EM，et al.Antitubercular constituents from Premna odorata Blanco[J].J Ethnopharmacol，2014，154（2）：471-474.

[18]Meng JC，Zhu QX，Tan RX.New antimicrobial mono-and sesquiterpenes from Soroseris hookeriana subsp.erysimoides[J].Planta Med，2000，66（6）：541-544.

[19] Mueller M，Hobiger S，Jungbauer A.Anti-inflammatory activity of extracts from fruits，herbs and spices[J].Food Chem，2010，122（4）：987-996.

[20] Domínguez M，Avila JG，Nieto A，et al.Anti-inflammatory activity of Penstemon gentianoides and Penstemon campanulatus[J].Pharm Biol，2011，49（2）：118-124.

[21] Wiseman M.The second World Cancer Research Fund/ American Institute for Cancer Research expert report：food，nutrition，physical activity，and the prevention of cancer：a global perspective[J].Proc Nutr Soc，2008，67（3）：253-256.

[22] Androutsopoulos VP，Mahale S，Arroo RR，et al.Anticancer effects of the flavonoid diosmetin on cell cycle progression and proliferation of MDA-MB 468 breast cancer cells due to CYP1 activation[J].Oncol Rep，2009，21（6）：1525-1528.

[23] Androutsopoulos V，Wilsher N，Arroo RR，et al.Bioactivation of the phytoestrogen diosmetin by CYP1 cytochromes P450[J].Cancer Lett，2009，274（1）：54-60.

[24] Androutsopoulos VP，Spandidos DA.The flavonoids diosmetin and luteolin exert synergistic cytostatic effects in human hepatoma HepG2 cells via CYP1A-catalyzed metabolism，activation of JNK and ERK and p53/p21 up-regulation[J].J Nutr Biochem，2013，24（2）：496-504.

（编辑：余庆华）

R969

A

1001-0408（2017）10-1426-04

2016-04-09

2016-08-02）

＊硕士研究生。研究方向：中药资源及其品质研究。电话：027-68890106。E-mail：llyangchn@163.com

#通信作者：教授，博士生导师。研究方向：中药资源及其品质研究。电话：027-68890106。E-mail：kelichen@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.35