小叶莲有效成分对人乳腺癌细胞增殖、细胞周期及线粒体膜电位的影响Δ

孔 越，王庆辉，尚明英#，肖军军，孟书聪，蔡少青（.北京大学药学院天然药物学系，北京 009；2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京 0090；.北京大学基础医学院细胞生物学系，北京009）

小叶莲有效成分对人乳腺癌细胞增殖、细胞周期及线粒体膜电位的影响Δ

孔 越1，2＊，王庆辉1，尚明英1#，肖军军3，孟书聪3，蔡少青1（1.北京大学药学院天然药物学系，北京 100191；2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京 100190；3.北京大学基础医学院细胞生物学系，北京100191）

目的：探讨小叶莲提取物、有效成分及成分组合对人乳腺癌细胞增殖的影响及机制。方法：采用酸性磷酸酶法测定小叶莲4种提取物[乙醇提取物（Xc）、乙醇提取物石油醚萃取物（Xp）、乙醇提取物乙酸乙酯萃取物（Xe）、乙醇提取物正丁醇萃取物（Xz）]、5种有效成分[鬼臼毒素（S1）、去氧鬼臼毒素（S2）、4-去甲去氧鬼臼毒素（S3）、8-异戊烯基山柰酚（S4）、8，2′-二异戊烯基槲皮素-3-甲醚（S5）]以及3种有效成分组合{组合1[S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），Z1]、组合2[S2-S4（1∶1），Z2]、组合3[S3-S4（1∶4），Z3]}对人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞增殖的影响；流式细胞仪检测上述样品对MDA-MB-231、MCF-7（或T47D）细胞周期和细胞线粒体膜电位的影响。结果：小叶莲有效成分组合Z1对MDA-MB-231、MCF-7细胞具有显著抑制作用，其半数抑制浓度（IC50）分别为（0.27±0.2）、（0.11±0.1）μg/mL；提取物Xc、Xp、Xe，有效成分S2、S4以及成分组合Z2、Z3对MDA-MB-231、MCF-7（或T47D）细胞的增殖均有较强抑制作用，IC50均小于15 μg/mL；各提取物和有效成分均可阻滞MDA-MB-231、MCF-7细胞周期于G2/M期；各有效成分组合均可阻滞MDA-MB-231、T47D细胞周期于G0/G1期，并能降低MDA-MB-231、T47D细胞线粒体膜电位。结论：小叶莲有效成分及成分组合可通过影响细胞周期和线粒体膜电位，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。

小叶莲；有效成分；有效成分组合；人乳腺癌MDA-MB-231细胞；人乳腺癌MCF-7细胞；人乳腺癌T47D细胞；细胞周期；线粒体膜电位

本课题组前期研究发现，小叶莲乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物以及小叶莲主要成分8，2′-二异戊烯基槲皮素-3-甲醚和槲皮素对人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤作用，对人乳腺癌T47D、MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖有明显抑制作用[2，8]。在前期研究基础上，本研究采用人乳腺癌T47D、MCF-7和MDAMB-231细胞株，对小叶莲乙醇提取物及其不同极性萃取部分、从小叶莲抗乳腺癌有效部位乙酸乙酯萃取物中分离得到的各种有效成分以及有效成分组合进行体外乳腺癌细胞增殖抑制试验，并初步探讨其对乳腺癌细胞周期和细胞线粒体膜电位的影响，为进一步明确小叶莲抗乳腺癌的有效成分和作用机制提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

680型Microplate Reader酶标仪（美国Bio-Rad公司）；FACS Clibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

1.2 药品与试剂

注射用顺铂（无菌分装粉针剂，齐鲁制药有限公司，批号：1060171DB，规格：10 mg）；紫杉醇注射液（扬子江药业集团有限公司，批号：10031812，规格：16.7 mL∶100 mg）；鬼臼毒素（S1）、去氧鬼臼毒素（S2）、4′-去甲去氧鬼臼毒素（S3）、8-异戊烯基山柰酚（S4）和8，2′-二异戊烯基槲皮素-3-甲醚（S5）为笔者从小叶莲中分离得到，通过1H-NMR、13C-NMR谱等方法鉴定其化学结构，经高效液相色谱（HPLC）-二级管阵列检测（DAD）面积归一化法测定各化合物纯度均高于98%；小叶莲有效成分组合1[S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），m/m/m/m，Z1]、组合2[S2-S4（1∶1），m/m，Z2]、组合3[S3-S4（1∶4），m/m，Z3]；小叶莲乙醇提取物（Xc）、乙醇提取物石油醚萃取物（Xp）、乙醇提取物乙酸乙酯萃取物（Xe）、乙醇提取物正丁醇萃取物（Xz）按文献[8]方法制备，单体化合物和有效成分组合以二甲基亚砜（DMSO）制备成浓度均为10µmol/mL的贮备液，即S1、S2、S3、S4的质量浓度分别为4.14、3.98、3.84、3.54、4.52 mg/mL，Z1、Z2、Z3的质量浓度分别为4.34、3.76、3.60 mg/mL；将小叶莲提取物以DMSO制备成质量浓度均为10 mg/mL的贮备液；DMEM培养基、新生小牛血清（美国Gibco公司）；硝基苯磷酸盐（美国Fluka公司）；其余试剂均为国产分析纯，均由北京化工厂生产。

1.3 细胞株

人乳腺癌MDA-MB-231细胞株、人乳腺癌MCF-7细胞株和人乳腺癌T47D细胞株由北京大学医学部肿瘤生物中心杜晓娟副教授提供。

2 方法

2.1 细胞培养

当地主要种植荔枝、柑桔、木瓜、番石榴、火龙果等经济作物。近两年，当地大力推行水肥一体化种植，这是转变农业施肥方式的一项先进农作物科学施肥技术。目前当地主推水肥一体化配套水溶肥、液体肥，很多农民都参加了培训。从今年开始，农药价格较去年同期上涨3.6%，化肥价格同比上涨7%，经销商积极性虽然提高，但仍不囤货。

人乳腺癌MDA-MB-231细胞株、人乳腺癌MCF-7细胞株和人乳腺癌T47D细胞株均用含10%新生小牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL链霉素的DMEM培养基于37℃、95%湿度、5%CO2的孵箱中培养，细胞接近融合时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，同时接种细胞进行试验。

2.2 酸性磷酸酶法检测细胞增殖及增殖抑制率

按照文献[15]方法，取对数生长期细胞消化后制成细胞悬液，按1.5×103个/孔的密度接种于96孔培养板中，培养24 h待细胞完全贴壁后，实验组分别加入1、5、25、50、100µg/mL质量浓度的小叶莲提取物或者浓度为1、5、10、50、100µmol/L的单体化合物和有效成分组合；阴性对照组加入DMEM培养液；顺铂组（阳性对照）分别加入1、2、4、6、8、10µg/mL质量浓度的顺铂溶液。每个浓度设6个复孔，分别于作用24、48、72 h后弃去培养基，各孔用磷酸盐缓冲液（PBS）100µL洗2遍，弃PBS，加入10 mmol/L的硝基苯磷酸盐溶液100µL（0.1 mol/L醋酸缓冲液制备，含0.1%Triton X-100），置于37℃孵育2 h后，每孔加入1 mol/L氢氧化钠溶液10µL终止反应。用酶标仪检测405 nm波长处吸光度（A），重复试验3次。计算细胞的增殖抑制率[增殖抑制率（%）＝（1－实验组平均A值/阴性对照组平均A值）×100%]。采用SPSS 21.0软件计算半数抑制浓度（IC50）。

2.3 流式细胞术检测细胞周期

小叶莲提取物和单体化合物的实验组采用人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞，Xc和Xe加入的质量浓度均为25µg/mL，S2、S3、S4加入的质量浓度分别为3.98、3.84、17.7µg/mL；有效成分组合的实验组采用人乳腺癌MDA-MB-231和T47D细胞，Z1、Z2、Z3加入的质量浓度分别为0.217、0.94、51.8µg/mL；阴性对照组加入DMEM培养液；紫杉醇组（阳性对照）加入紫杉醇2µg/mL。上述各组分别于作用24、48 h后，用胰蛋白酶溶液消化细胞，PBS洗涤，加入冰预冷的70%乙醇3 mL，4℃固定1 h，PBS洗涤2次，加入0.2 mg/mL RNA酶室温保温30min，加入终质量浓度为20 mg/L的碘化丙啶，温育30 min。应用流式细胞仪检测样品对乳腺癌细胞周期的影响，不同分期细胞所占比例采用ModFit LT细胞周期分析软件进行分析。

2.4 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位

人乳腺癌MDA-MB-231和T47D细胞株在DMEM培养液中培养。小叶莲有效成分组合实验组Z1、Z2、Z3加入质量浓度分别为0.217、0.94、1.8µg/mL，阴性对照组加入DMEM培养液，紫杉醇组（阳性对照）加入紫杉醇2 µg/mL。作用24 h后，经胰蛋白酶溶液消化细胞，冷PBS洗涤，500 μL PBS重悬细胞，再加入500 μL Rhodamine 123（10 mg/L）用以标记活细胞，终浓度为0.14 μmol/L。37Ⅴ孵育30 min后，PBS洗涤细胞3次，PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位（激发波长为488 nm，发射波长为525 nm）。

3 结果

3.1 小叶莲提取物、有效成分和成分组合对人乳腺癌细胞增殖的影响

3种小叶莲提取物Xc、Xp、Xe均可较好地抑制MDAMB-231细胞的增殖，Xz作用不明显；5种单体化合物对MDA-MB-231细胞的增殖均有一定抑制作用，以S3作用最强；在高浓度（100µmol/L）时2种异戊烯基黄酮类成分S4、S5表现出较强的抑制作用，其抑制率分别为94.8%、98.6%，其作用强于3种木脂素类成分S1、S2、S3（抑制率分别为50.0%、60.2%、69.9%）；3种有效成分组合中以Z1作用最强。

各样品对MCF-7细胞的增殖均有一定的抑制作用，4种不同极性小叶莲提取物中以Xe的作用最强；5种单体化合物中以S2作用最强，S4、S5则在高浓度（100 µmol/L）下表现出较强的抑制活性（抑制率分别为81.2%、92.1%）；3种有效成分组合中以Z1作用最强。IC50测定结果见表1。

3.2 小叶莲提取物、有效成分和成分组合对细胞周期的影响

3.2.1 小叶莲提取物及有效成分对MDA-MB-231和MCF-7细胞周期的影响 小叶莲各提取物和单体化合物与MDA-MB-231细胞分别作用24 h后，与阴性对照组比较，各实验组G0/G1期细胞比例明显降低，G2/M期细胞比例明显升高；小叶莲各提取物和单体化合物与MCF-7细胞分别作用24 h后，与阴性对照组比较，各实验组G0/G1期细胞比例显著升高、S期细胞比例明显降低；紫杉醇组也表现出同样的抑制作用，结果见表2。

3.2.2 小叶莲有效成分组合对MDA-MB-231、T47D细胞周期的影响 小叶莲有效成分组合与MDA-MB-231、T47D细胞分别作用24 h后，与阴性对照组比较，各实验组G0/G1期细胞比例明显降低，G2/M期细胞比例明显升高；紫杉醇组也表现出同样的抑制作用，结果见表3。

表1 小叶莲提取物、有效成分和成分组合作用48 h后对细胞的IC50测定结果（s，µg/mL，n＝6）Tab 1 Determination results of IC50of Sinopodophylli Fructus extracts，active constituents，constituent combination on cell after 48 h（s，µg/ mL，n＝6）

表1 小叶莲提取物、有效成分和成分组合作用48 h后对细胞的IC50测定结果（s，µg/mL，n＝6）Tab 1 Determination results of IC50of Sinopodophylli Fructus extracts，active constituents，constituent combination on cell after 48 h（s，µg/ mL，n＝6）

注：“-”表示IC50＞100µg/mLNote：“-”means IC50＞100µg/mL

MDA-MB-231MCF-7 21.27±0.3 14.01±0.1 1.00±0.4 0.62±0.1 -2.68±0.2 2.10±0.3 0.28±0.1 10.20±0.5 11.50±0.4 0.27±0.2 2.72±0.3 1.27±0.2组别阴性对照组顺铂组Xc组Xp组Xe组Xz组S1组S2组S3组S4组S5组Z1组Z2组Z3组25.96±0.4 2.67±0.2 2.08±0.3 1.26±0.1 16.59±0.5 9.08±0.4 1.00±0.1 16.55±0.4 10.24±0.6 24.40±0.5 0.11±0.1 5.43±0.4 0.74±0.1

表2 小叶莲提取物及有效成分作用24 h后对MDAMB-231、MCF-7细胞周期的影响（%%）Tab 2 Effects of Sinopodophylli Fructus extracts and active constituents on MDA-MB-231，MCF-7 cell cycle after 24 h（%%）

表3 小叶莲有效成分组合作用24 h后对MDA-MB-231、T47D细胞周期的影响（%%）Tab 3 Effects of Sinopodophylli Fructus active constituents on MDA-MB-231 and T47D cell cycle after 24 h（%%）

3.3 小叶莲有效成分组合对细胞线粒体膜电位的影响

小叶莲有效成分组合Z1、Z2、Z3作用MDA-MB-231、T47D细胞24 h后，弱荧光细胞（M1）与阴性对照组比较开始增多，常荧光细胞（M2）相应地减少，提示MDAMB-231和T47D细胞在不同的小叶莲有效成分组合作用下，线粒体跨膜电位受到影响而下降，使得进入细胞内的荧光染料减少、M1百分比增高。

表4 小叶莲有效成分组合对人乳腺癌MDA-MB-231和T47D细胞线粒体膜电位的影响（%%）Tab 4 Effects of Sinopodophylli Fructus active constituents on mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231，T47D cell after 24 h（%%）

4 讨论

本研究在前期研究工作的基础上通过细胞试验进一步证明了小叶莲提取物乙酸乙酯部位为小叶莲抑制乳腺癌的有效部位。从小叶莲乙酸乙酯萃取物中分离得到的5种单体化合物，其中3种鬼臼毒素类木脂素S1、S2和S3对2种类型乳腺癌细胞均表现出了较强的抑制作用，S3对MDA-MB-231细胞的抑制作用最强，S2则对MCF-7细胞的抑制作用最强；异戊烯基黄酮类化合物S4和S5在高浓度（100µmol/L）下对人乳腺癌细胞MDAMB-231和MCF-7的增殖表现出较强的抑制作用。3种有效成分组合分别为根据各单体化合物在小叶莲药材中的含量比例配合而成，其中Z1为3种鬼臼毒素类木脂素和2种异戊烯基黄酮类成分按一定比例组合而成，其对乳腺癌细胞的抑制作用强于各单体化合物。结果提示，小叶莲中所含的木脂素类和异戊烯基黄酮类化合物可能通过不同的作用途径发挥抗乳腺癌活性，各有效成分组合会产生叠加作用。

本研究用实验样品对3种乳腺癌细胞周期的影响不同（因不同实验阶段实验室内细胞生长等原因，小叶莲提取物和单体化合物选择MDA-MB-231和MCF-7细胞株，化合物组合样品选择MDA-MB-231和T47D细胞株）。对于乳腺癌细胞株MDA-MB-231，Xc、Xe及S2、S3、S4及成分组合Z1、Z2、Z3均将细胞阻滞在G2/M期；对于乳腺癌细胞株T47D，各有效成分组合Z1、Z2、Z3均将细胞阻滞在G2/M期；而对于乳腺癌细胞株MCF-7，提取物及各单体化合物将细胞阻滞在G0/G1期。小叶莲提取物、有效成分及成分组合对不同的乳腺癌细胞周期产生的影响不同，各有效成分组合均能降低MDA-MB-231细胞和T47D细胞线粒体膜电位，具体作用机制有待进一步研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：46.

[2] Kong Y，Xiao JJ，Meng SC，et al.A new cytotoxic flavonoid from the fruits of Sinopodophyllum hexandrum[J]. Fitoterapia，2010，81（5）：367-370.

[3] 尚明英，李萍，李军，等.藏药小叶莲的化学成分研究[J].中草药，2000，31（8）：569-571.

[4] 尚明英，徐国钧，徐珞珊，等.HPLC法测定鬼臼类生药中鬼臼木脂素的含量[J].中国药科大学学报，1996，27（4）：219-222.

[5] 王蔼华，刘广学，徐风，等.小叶莲化学指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2013，38（20）：3528-3533.

[6]Wang AH，Kong Y，Shang MY，et al.Simutaneous quantification of eight active compounds in Sinopodophyllum hexandrum by HPLC-DAD[J].J Chin Pharmaceu Sci，2015，24（6）：376-382.

[7] 尚明英，蔡少青，徐珞珊，等.鬼臼类中药及其木脂素类成分的药效学研究[J].中草药，2002，32（8）：722-724.

[8] 郭帅，王璐，苏丹，等.小叶莲提取物抗乳腺肿瘤活性研究[J].中国药房，2014，25（7）：577-580.

[9] 宗玉英，党合群，骆桂法，等.110种藏药抗肿瘤体外筛选实验研究[J].药学实践杂志，2000，18（5）：290-291.

[10] Gordaliza M，Castro MA，Del Corral JM，et al.Antitumor properties of podophyllotoxin and related compounds [J].Curr Pharm Des，2000，6（18）：1811-1839.

[11] Ren W，Qiao Z，Wang H，et al.Flavonoids：promising anticancer agents[J].Med Res Rev，2003，23（4）：519-534.

[12] 李文魁，林新，罗崇念，等.异戊烯基黄酮在植物界的分布及其生理活性[J].国外医药植物药分册，1995，10（5）：211-213.

[13] 孙彦君，纪宝玉，冯卫生，等.8-异戊烯基山柰酚研究进展[J].中药材，2013，36（9）：1537-1541.

[14] Ma LM，Xu F，Li FC，et al.The profiling and identification of the metabolites of 8-prenylkaempferol and a study on their distribution in rats by high-performance liquid chromatography with diode array detector and combined with electrospray ionization ion trap time-of-flight multistage mass spectrometry[J].Biomed Chromatogr，2016，30（2）：175-190.

[15] Yang TT，Sinai P，Kain SR.An acid phosphatase assay for quantifying the growth of adherent and nonadherent cells[J].Anal Biochem，1996，241（1）：103-108.

Effects of Active Constituents ofSinopodophylli Fructuson Cell Proliferation，Cell Cycle and Mitochondrial Membrane Potential of Human Breast Cancer Cell

KONG Yue1，2，WANG Qinghui1，SHANG Mingying1，XIAO Junjun3，MENG Shucong3，CAI Shaoqing1（1.Dept.of Natural Medicines，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China；2.Patent Examination Cooperation Center of State Intellectual Property Office，Beijing 100190，China；3.Dept.of Cell Biology，School of Basic Medical Sciences，Peking University，Beijing 100191，China）

OBJECTIVE：To explore the effects and mechanism of extracts，active constituents and constituent combination of Sinopodophylli Fructus on cell proliferation of human breast cancer.METHODS：Acid phosphatase method was conducted to determine the effects of 4 extracts[ethanol extract（Xc），petroleum ether extract from ethanol extract（Xp），ethyl acetate extract from ethanol extract（Xe），n-butanol extract from ethanol extract（Xz）]，5 active constituents[podophyllotoxin（S1），deoxypodophyllotoxin（S2），4-desmethyl deoxypodophyllotoxin（S3），8-isopentenyl kaempferol（S4），8，2′-diisoprenyl quercetin-3-methyl ether（S5）]and 3 active constituent combination[combination 1，S1-S2-S3-S4-S5（2∶4∶1∶4∶32），Z1；combination 2，S2-S4（1∶1），Z2；combination 3，S3-S4（1∶4），Z3]on the MDA-MB-231，MCF-7 cell proliferation；flow cytometry was adopted to detect the effects of above-mentioned samples on MDA-MB-231，MCF-7（T47D）cell cycle and mitochondrial membrane potential.RESULTS：The active constituent combination Z1showed significant inhibitory effects on MDA-MB-231，MCF-7 cells，the half inhibitory concentrations（IC50）were（0.27±0.2），（0.11±0.1）μg/mL；extracts Xc，Xp，Xe，active constituents S2，S4and active constituent combination Z2，Z3showed relatively strong inhibitory effects on MDA-MB-231，MCF-7（T47D）cell proliferation（IC50＜15 μg/mL）. Both extracts and active constituents can block MDA-MB-231，MCF-7 cell cycle in G2/M phase；all active constituents can block MDA-MB-231，T47D cell cycle in G0/G1phase，and can reduce MDA-MB-231，T47D cell mitochondrial membrane potential. CONCLUSIONS：The active constituents and constituent combination of Sinopodophylli Fructus can inhibit cell proliferation of breast cancer by affecting cell cycle and mitochondrial membrane potential.

Sinopodophylli Fructus；Active constituent；Active constituent combination；Human breast cancer MDAMB-231 cells；Human breast cancer MCF-7 cells；Human breast cancer T47D cells；Cell cycle；Mitochondrial membrane potential

R931.6

A

1001-0408（2017）10-1368-04

2016-05-14

2016-12-23）

（编辑：林 静）

国家科技重大专项重大新药创制项目（No.2013ZX09103002-006，2009ZX09308-004）；中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室项目（No.2010JZ-W-01）

＊硕士。研究方向：中药活性成分。电话：010-62413792。E-mail：kong.yue@foxmail.com

#通信作者：副教授，硕士生导师，博士。研究方向：中药药效物质与质量标准。电话：010-82802534。E-mail：myshang@bjmu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.19