淫羊藿苷对自发性高血压大鼠肾损伤的改善作用及机制研究Δ

朱 玲，钱志强，李叶丽，王俊逸，杨 华，杨丹莉#（.遵义医学院药理学教研室/基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州遵义 563000；.遵义医学院附属医院病理科，贵州遵义 563000）

淫羊藿苷对自发性高血压大鼠肾损伤的改善作用及机制研究Δ

朱 玲1＊，钱志强1，李叶丽1，王俊逸1，杨 华2，杨丹莉1#（1.遵义医学院药理学教研室/基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州遵义 563000；2.遵义医学院附属医院病理科，贵州遵义 563000）

目的：观察淫羊藿苷（ICA）对自发性高血压大鼠（SHR）肾组织病理损伤的影响，并基于核因子κB（NF-κB）信号通路研究其作用机制。方法：将21只SHR随机均分为模型组和ICA低、高剂量组（20、40 mg/kg，记为ICA-L、ICA-H组），另取7只同源京都大鼠（WKY）为对照组。各组大鼠ig给药，每日2次，连用11周；对照组和模型组大鼠ig等体积双蒸水。观察各组大鼠肾组织病理学变化；蛋白质印迹法检测肾组织磷酸化NF-κB-p65（p-NF-κB-p65）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）蛋白的表达。结果：与对照组比较，模型组大鼠肾结构出现紊乱，肾小球囊腔狭窄且不规则；IκB蛋白的表达明显下调，p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表达均明显上调（P＜0.01）。与模型组比较，ICA-L、ICA-H组大鼠肾组织上述病理变化有所改善；ICA-L、ICA-H组IκB蛋白的表达均明显上调（P＜0.05或P＜0.01），ICA-H组大鼠p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表达均明显下调（P＜0.01），ICA-L组大鼠p-NF-κB-p65蛋白表达明显下调（P＜0.05），而ICA-L组大鼠TNF-α蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：ICA具有改善SHR肾病理性损伤的作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路相关。

淫羊藿苷；自发性高血压大鼠；肾组织；磷酸化核因子κB-p65；肿瘤坏死因子α

近年来，高血压肾病患者的数量呈逐年上升趋势[1]，其为高血压的主要并发症之一[2]。自发性高血压大鼠（SHR）是目前公认的研究原发性高血压及其并发症的动物模型。淫羊藿系小檗科淫羊藿属植物，为我国传统补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿的主要活性成分之一，具有降压、改善缺血再灌注损伤、增强免疫力等作用[3-4]。本课题组前期研究发现，ICA可降低SHR血压，改善其左心室重构、减轻肾纤维化、对抗肾小管上皮细胞凋亡[5-7]。据文献报道，核因子κB（NF-κB）信号通路在高血压肾损伤的发生、发展中起着枢纽作用[8]。因此，在本研究中笔者拟探讨ICA对SHR肾实质损伤的改善作用，并探讨这一作用是否与其抑制NF-κB信号通路的机制有关，以期为ICA的进一步应用提供理论基础。

1 材料

1.1 仪器

Mastercycler Gradient梯度聚合酶链式反应仪（德国Eppendorf公司）；Supply Mini-Protean3电泳仪、Trans Blor TurhoMini Trans-Blot转移系统、Universal Hood 11 CCD成像系统（美国Bio-Rad公司）；BX43+DP2b Olympus光学显微镜及照相系统（日本Olympus公司）。

1.2 药品与试剂

ICA原料药（南京泽朗医药有限公司，批号：FY17420615，纯度：≥98%）；磷酸化NF-κB-p65（p-NF-κB-p65）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）兔源多抗（美国Abcam公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（上海康成生物技术有限公司）；免疫印迹化学发光试剂（ECL，上海七海生物有限公司）；HRP标记的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（H+L）二抗（江苏碧云天生物技术研究所）。

1.3 实验动物

SHR 21只，♂，14周龄；同源京都大鼠（WKY）7只，♂，体质量均为260～300 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2012-0001]。

2 方法

2.1 分组与给药

21只SHR随机均分为模型组和ICA低、高剂量组（20、40 mg/kg，记为ICA-L、ICA-H组），给药剂量根据前期预实验确定[5]，低剂量相当于人临床等效剂量的6.3倍[9]；另取7只WKY作为对照组。所有大鼠适应性饲养1周后ig给药，每日2次，连用11周；对照组和模型组大鼠ig等体积双蒸水。

2.2 各组大鼠肾组织病理观察

实验结束后，各组大鼠ip7%水合氯醛（0.53 g/kg）麻醉后处死，取肾组织置于4%甲醛溶液中固定48 h后，行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察肾组织病理变化。

2.3 各组大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表达

采用蛋白质印迹（Western blot）法测定。称取“2.2”项下大鼠肾组织约0.1 g，剪碎后置于1 mL RIPA裂解液中，加入苯甲基磺酰氟10 μL，冰上匀浆后静置30 min，4℃离心（离心半径为9 cm，12 000 r/min）20 min。取上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯法测定待测样品的总蛋白浓度。每孔上样量为30 μg，蛋白配置为10 μL上样体系。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，上层为5%浓缩胶，下层为12%分离胶。电泳后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot转移系统聚偏氟乙烯（PVDF）膜转膜，5%蛋白封闭液封闭2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗结合：GAPDH（1∶5 000）、p-NF-κB-p65（1∶500）、IκB（1∶2 000）、TNF-α（1∶2 000），4℃过夜；TBST洗膜，HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶2 000），常温孵育1.5 h，ECL化学发光显色，采用Bio-Rad CCD成像系统获取图像。

2.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对所得数据进行分析。采用ONE-WAYANOVA检验，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett T3法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肾组织病理观察结果

光镜观察结果显示，对照组大鼠肾小球、肾小管结构正常；与对照组比较，模型组大鼠肾小球囊腔狭窄且不规则，肾小球系膜基质增多，毛细血管扩张充血，细胞排列紊乱，肾小管上皮细胞水肿、管腔狭窄；与模型组比较，ICA-L、ICA-H组大鼠肾小球囊腔增宽，部分毛细血管扩张充血，细胞排列紊乱有所改善，毛细血管管腔开放良好，肾小管上皮细胞水肿减轻，详见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理观察结果（×400）Fig 1 Pathological observation results of kidney tissue of rats in each group（×400）

3.2 各组大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α表达结果

与对照组比较，模型组大鼠IκB蛋白的表达明显下调（P＜0.01），p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表达均明显上调（P＜0.01）；与模型组比较，ICA-L、ICA-H组大鼠IκB蛋白的表达明显上调（P＜0.05或P＜0.01），ICA-H组p-NF-κB-p65、TNF-α蛋白的表达均明显下调（P＜0.01），ICA-L组p-NF-κB-p65蛋白表达明显下调（P＜0.05），而ICA-L组TNF-α蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），详见图2、表1。

4 讨论

高血压是心脑血管疾病、肾疾病等的重要危险因素。高血压肾病通常是指原发性高血压导致的肾小动脉或肾实质损害，又称为高血压肾硬化症。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肾小球囊腔狭窄且不规则，肾小球系膜基质增多，毛细血管扩张充血，细胞排列紊乱，肾小管上皮细胞水肿、管腔狭窄，说明SHR出现了高血压肾实质损害的病理改变。然而，给予ICA-L、ICA-H后，SHR紊乱的肾结构有所减轻，这与之前报道ICA具有改善SHR肾病理性损害的结论[6]相一致。

图2 各组大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表达电泳图Fig 2 Electrophoresis chart of protein expressions of p-NF-κB-p65，IκB，TNF-α of rats in each group

表1 各组大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表达水平（s，n＝10）Tab 1 Protein expression levels of p-NF-κB-p65，IκB，TNF-α of rats in each group（s，n＝10）

表1 各组大鼠p-NF-κB-p65、IκB、TNF-α蛋白表达水平（s，n＝10）Tab 1 Protein expression levels of p-NF-κB-p65，IκB，TNF-α of rats in each group（s，n＝10）

注：与对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01 Note：vs.control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α 0.49±0.10 1.17±0.10＊＊1.11±0.12 0.82±0.07##组别对照组模型组ICA-L组ICA-H组p-NF-κB-p65 0.82±0.17 1.26±0.06＊＊1.12±0.06#0.94±0.10##IκB 1.35±0.22 0.64±0.18＊＊0.95±0.07#1.21±0.08##

静息状态下，NF-κB以p65/p50异源二聚体的形式与其抑制蛋白IκB结合存在于细胞质中，无活性。当细胞受到病毒、机械力、氧化应激、炎症因子等刺激时，IκB在IκB激酶的作用下发生磷酸化并降解，NF-κB被激活，磷酸化的p65/p50迅速从胞浆转移至胞核，尤其是p65亚型，与DNA链上的κB位点结合，启动级联反应，诱导TNF-α、白细胞介素1β等转录。在高血压状态下，NF-κB激活可造成肾损害[10]。在本研究中，与对照组比较，模型组大鼠肾组织IκB蛋白的表达明显下调，p-NF-κB-p65水平明显升高。然而，给予ICA后，SHR的IκB蛋白表达明显上调，p-NF-κB-p65的水平明显降低。这提示ICA可能通过抑制NF-κB的激活和IκB降解，从而减轻SHR肾病理性损伤。

TNF-α是NF-κB的下游因子之一[11]，参与了高血压肾损害的发生和发展[12-13]，也是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎症因子，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。Elmarakby AA等[14]研究发现，TNF-α阻滞药可减轻盐敏感高血压大鼠的慢性肾损伤。在本研究中，与对照组比较，模型组大鼠肾组织的TNF-α蛋白表达明显上调，而ICA可明显下调TNF-α蛋白表达。这提示ICA可能通过抑制NF-κB信号，下调TNF-α蛋白表达，从而减轻SHR肾病理性损伤。

综上所述，ICA具有改善SHR肾病理性损伤的作用，其机制可能与其抑制NF-κB信号通路相关。

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Study on Improvement Effect and Mechanism of Icariin on Renal Lesion in Rats with Spontaneous Hypertension

ZHU Ling1，QIAN Zhiqiang1，LI Yeli1，WANG Junyi1，YANG Hua2，YANG Danli1（1.Teaching and Research Office of Pharmacology/the Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563000，China；2.Dept.of Pathology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563000，China）

OBJECTIVE：To observe the effect of pathological lesion of renal tissue in rats with spontaneous hypertension（SHR），and study its mechanisms based on nuclear factor κB（NF-κB）signaling pathway.METHODS：21 SHR were randomly divided into model group and ICA low-dose，high-dose groups（20，40 mg/kg，denoted by ICA-L，ICA-H groups）；other 7 homologous Kyoto rats（WKY）were regarded as control group.All rats were intragastrically administrated，twice a day，for 11 weeks，rats in control group and model group received equal volume of double distilled water，ig.Pathological changes in renal tissue in each group were observed；Western blot method was used to detect protein expressions of p-NF-κB-p65，IκB and TNF-α in renal tissue.RESULTS：Compared with control group，model group showed disorder renal structure，narrow and irregular glomerular cysts；the protein expression of IκB was significantly down-regulated，protein expressions of p-NF-κB-p65 and TNF-α were significantly up-regulated（P＜0.01）.Compared with model group，the above-mentioned changes of rats showed improvement in ICA-L，ICA-H groups；the protein expression of IκB was significantly up-regulated in ICA-L，ICA-H groups（P＜0.05 or P＜0.01）；the protein expressions of p-NF-κB-p65 and TNF-α were significantly down-regulated（P＜0.01）in ICA-H groups；p-NF-κB-p65 protein expression was significantly down-regulated in ICA-L group（P＜0.05）；while there was no significant difference in TNF-α protein expression in ICA-L group（P＞0.05）.CONCLUSIONS：ICA plays a role in improving renal pathological lesion in SHR，and the mechanism may be related to inhibiting NF-κB signaling pathway.

Icariin；Spontaneously hypertension rats；Renal tissue；p-NF-κB-p65；TNF-α

R965

A

1001-0408（2017）10-1326-03

2016-06-06

2017-02-07）

（编辑：刘明伟）

国家自然科学基金资助项目（No.81241142，81660679）

＊硕士研究生。研究方向：心血管药理学、抗炎免疫药理学。电话：0851-28643568。E-mail：lingluhappy@foxmail.com

#通信作者：教授，硕士生导师，博士。研究方向：心血管药理学、抗炎免疫药理学。电话：0851-28643568。E-mail：zmuyangdanli@foxmail.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.08