地黄饮子对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织超氧化物歧化酶、丙二醛及其空间学习记忆能力的影响

周景慧



·基础医学· ·论著·

地黄饮子对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织超氧化物歧化酶、丙二醛及其空间学习记忆能力的影响

周景慧

目的 探讨地黄饮子对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 选取健康清洁级Wistar大鼠72只，雌雄不限，体质量260～280 g，随机分为A组、B组、模型组、正常组，每组18只。A组：在造模后每日灌服地黄饮子36 g/kg。B组：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg。模型组：造模后胃灌盐水1次/d。正常组：正常饮食。前3组造模：夹闭大鼠双侧颈总动脉，大鼠发生脑缺血再灌注损伤。灌药3周后检测脑组织内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。Morris水迷宫实验和跳台实验比较大鼠学习记忆能力，测量大鼠脑梗死面积。结果 模型组中SOD含量[(93.42±18.78) kU/g prot]明显低于正常组[(158.36±22.32) kU/g prot]，MDA含量[(6.35±2.04) μmol/g prot]明显高于对照组[(2.63±1.86) μmol/g prot]，差异有统计学意义(P<0.05)，本实验造模成功。A组[(135.34±20.12) kU/g prot]和B组[(132.78±19.56) kU/g prot]的SOD含量明显高于模型组，MDA含量[A组：(3.46±1.75) μmol/g prot]，B组：(3.82±1.82) μmol/g prot]明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组的学习能力和记忆能力的错误次数、潜伏期均明显少于模型组，A组和B组的潜伏期均明显少于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组的脑梗死面积均明显小于模型组，且A组的脑梗死面积明显小于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 地黄饮子能够改善受损的脑细胞血液循环减少梗死面积，改善大脑的能量代谢，改善被抑制的神经细胞，修复神经功能缺损，保护受损的神经元。

地黄饮子；脑缺血再灌注损伤；保护作用

地黄饮子出自《圣济总录》五十一卷[1]，地黄饮子具有驱毒化瘀、滋肾阴、补肾阳、化痰等功效，能够促进内源性神经干细胞增殖和迁移，补充缺血区的神经元，修复神经损伤[3]。近年来，发现脑缺血再灌注后神经细胞数量减少，部分神经功能缺失[4]。本研究通过地黄饮子治疗脑缺血再灌注大鼠，观察大鼠的学习记忆能力及对脑组织的保护作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

由中国医科大学提供健康清洁级Wistar大鼠72只，编号：SCXK-LN2013-0007，雌雄不限，体质量260～280 g。按数字表法随机分为A组、B组、模型组、对照组，每组18只。A组、B组、模型组制造脑缺血再灌注模型。A组：每日灌服地黄饮子汤36 g/kg。B组：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg(天津药业生产，批号：20130067，规格：20 mg/片。与注射用水溶解)。模型组：造模后每日胃灌盐水1次。正常组：正常饮食。均灌药3周。

1.2 动物模型的建造

用10%水合氯醛腹腔麻醉、固定，颈部正中切开，两侧分别分离双侧颈总动脉并钳夹30 min(纱布覆盖切口创面)，松开动脉夹30 min，再次钳夹30 min，松开动脉钳，模型完成。

造模完成后每组随机取出1只大鼠断头，取脑组织称重，加缓冲液制成1∶9体积的脑组织匀浆液，离心后取上清液，采用羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量(参照南京建成生物研究所的说明书进行)。

1.3 药物配方

参照《黄帝素问宣明论方》配制地黄饮子方法：熟地黄12 g、山茱萸15 g、炮附子15 g、白茯苓12 g、石斛15 g、麦门冬15 g、菖蒲12 g、巴戟天15 g、肉苁蓉15 g、官桂10 g、五味子10 g、远志10 g。煎煮2次，每次1 h，将2次药液混合，用旋转仪蒸发浓缩，干燥密封。

1.4 仪器

中国医科大学实验部提供Morris水迷宫实验记录仪和跳台仪，光学显微镜。

1.5 实验方法

1.5.1 定位航行实验 实验共4 d，每天训练3次，每次1 min，训练场地由一圆形水池和移动平台组成，水池上方有摄像机和监视器与电脑连接，记录大鼠的游行轨迹、路程、到达平台的时间(潜伏期)。实验前将池中注入清水和牛奶，使水池变成不透明的颜色，水温保持在24 ℃，水池分为4个象限，并在密室内进行实验。在实验前1 d将大鼠放入水池中适应环境2 min。第2天开始进行实验，大鼠在池中1 min内若未能找到平台，潜伏期为60 s，在平台上休息60 min后再次重复训练，每只大鼠训练3次，连续训练4 d，分别记录每只的错误次数和潜伏期。

1.5.2 跳台实验 定位航行实验后在跳台记录仪上进行，检测大鼠快速记忆的潜伏期。实验前大鼠先适应环境5 min后通电，每日每只大鼠训练3次，电脑记录大鼠在3 min内双足同时跳上绝缘台次数和潜伏期。连续训练5 d。

1.6 测量大鼠脑梗死面积

定位航行实验和跳台实验结束后，断头取脑，间隔2 mm连续冠状切片，快速加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸液中进行TTC染色，用电镜图像分析脑组织内梗死面积比值(梗死面积/视野下全脑面积)。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0进行统计分析，以均数±标准差(x±s)表示，Morris水迷宫实验使用ANOVA分析，用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地黄饮子对大鼠脑组织内SOD、MDA含量的影响

模型组中SOD含量明显低于正常组，MDA含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，本实验造模成功。A组和B组的SOD含量明显高于模型组，MDA含量明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 地黄饮子对大鼠脑组织内SOD、MDA含量的影响(x±s)

注：与正常组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05。SOD：超氧化物歧化酶，MDA：丙二醛。A组：每日灌服地黄饮子汤36 g/kg，B组：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

2.2 地黄饮子对大鼠定位航行能力的影响

模型组的学习能力和记忆能力的错误次数、潜伏期均明显多于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组的学习能力和记忆能力的错误次数、潜伏期均明显少于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 地黄饮子对大鼠定位航行能力的影响(x±s)

注：与正常组比较aP<0.05;与模型组比较bP<0.05。A组：每日灌服地黄饮子汤36 g/kg，B组：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

2.3 地黄饮子对大鼠跳台实验潜伏期的影响

模型组的潜伏期均明显长于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组的潜伏期均明显短于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 地黄饮子对大鼠脑梗死面积的影响

模型组的脑梗死面积为38.36%，正常组脑梗死面积为0。A组和B组的脑梗死面积均明显小于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；且A组的脑梗死面积明显小于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 地黄饮子对大鼠跳台实验潜伏期的影响(s，x±s)

注：与正常组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05。A组：每日灌服地黄饮子汤36 g/kg，B组：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

表4 地黄饮子对大鼠脑梗死面积的影响(%)

注：与正常组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05。A组：每日灌服地黄饮子汤36 g/kg，B组：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

3 讨论

脑缺血再灌注导致脑内氧自由基产生、细胞炎性因子释放，刺激海马区的神经干细胞增殖，但是由于细胞膜的通透性改变、细胞水肿、细胞能量代谢障碍、神经功能损伤，增殖的神经细胞很难迁移至缺血区，分化并补充受损的神经元。有研究发现[5-6]，而地黄饮子对脑内神经细胞的增殖和迁移起重要作用，它能够促进缺血区SDF1、CXCR4、BDNF蛋白表达增加，SDF1、CXCR4、BDNF均具有调节脑内神经元信息传递、促进神经干细胞增殖粘附、调节新生神经元分化、修复受损的神经元等作用，因此，地黄饮子[7]能够修复受损的神经元，保护脑神经。SOD和MDA是体内常见的抗氧化因子，SOD的作用是直接清除因氧化反应产生的氧自由基，MDA作用是脂质发生氧化反应后代谢产物，都代表发生氧化反应的程度[8]。

有研究证实[9]，脑组织缺血缺氧导致脑组织内SOD含量降低、MDA含量增高，而本实验测得模型组SOD含量减少、MDA含量增高，证实模型制作成功。因此本实验证实地黄饮子能够提高脑组织内抗氧化的能力，减少细胞发生氧化损伤；同时地黄饮子改善脑组织细胞膜的通透性，延缓大脑衰老，保护脑细胞的作用。

水迷宫实验和跳台实验是较好的测试大脑空间学习、记忆能力的工具。本实验得出结果地黄饮子灌喂后大鼠的学习记忆能力增强，脑梗死面积减少，本实验结果证实地黄饮子能够改善受损的脑细胞血液循环减少梗死面积，改善被抑制的神经细胞，修复神经功能缺损，保护受损的神经元，改善大脑的能量代谢，减轻海马区损伤的神经元，最终提高了学习记忆能力，同时地黄饮子能够促进神经干细胞增殖和迁移到受损脑区，修复脑神经细胞的正常功能。本实验结果与成金枝等[10]的结果一致，

综上所述，地黄饮子可改善神经细胞迁移，修复受损的神经元，为研究中药促进内源性神经再生的作用机制，提供了新的研究思路。

[1] 何德山. 地黄饮子探源[J]. 江西中医药, 2003, 34(4): 31-33. DOI:10.3969/j.issn.0411-9584.2003.04.023.

[2] 白黎明，闫咏梅，张晓双.地黄饮子对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(1):84-85.

[3] 王倩，范文涛，贺文舜.地黄饮子含药血清对胎鼠海马神经干细胞迁移的影响[J].中医药学报，2015，43(1)：8-10.

[4] 何华，王桂香，钟士江，等. 地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 山东医药, 2006, 46(4): 28-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2006.04.012.

[5] 王倩，范文涛，贺又舜. 地黄饮子含药血清对海马脑片SD F-1的影响[J]. 陕西中医, 2015, 36(3): 373-375. DOI:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.058.

[6] 范文涛，王倩. 地黄饮子对急性脑缺血大鼠神经干细胞迁移的影响[J]. 中医学报, 2013, 28(12): 1834-1835.

[7] 张赓，吴金娟，姜淼，等. 中医药治疗阿尔兹海默病的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014, 20(6): 217-222.

[8] 白黎明，闫咏梅，张晓双. 地黄饮子对大鼠局灶性脑缺血的保护作用[J]. 西北药学杂志, 2012, 27(2): 131-132. DOI:10.3969/j.issn.1004-2407.2012.02.015.

[9] 谭永星，李雪梅，文素芳.不同时间脑室注射BDNF对大鼠脑缺血再灌注损伤氧化应激及神经细胞凋亡的影响[J].第四军医大学学报,2009,30(18):1681-1684.

[10] 成金枝，张俊龙，郭蕾，等. 地黄饮子传统饮片汤剂与中药免煎颗粒冲剂对快速衰老小鼠行为学影响的实验研究[J]. 世界中西医结合杂志, 2014, 9(3): 242-244.

(本文编辑：林永丽)

Protective effects of rehmannia Yinzi on ischemic injury induced by reperfusion in rats

ZhouJinghui

(AffiliatedHospitalofLiaoningChineseHerbalMedicineUniversity,Shenyang110032,China)

Objective To explore the protective effects of rehmannia Yinzi on ischemic injury induced by reperfusion in rats.Methods Seventy-two clean-grade Wistar rats with a body weight of 260-280 g were randomly divided into 4 groups: group A, group B, the model group and the normal control group, each consisting of 18 animals. For the animals of group A, rehmannia Yinzi liquid was given by gavage at a dose of 36 g/kg following development of the model, and for animals of group B, nimodipine was given also by gavage at a dose of 12.5 mg/kg. The animals of the model group received physiological saline by gavage following development of the model, and the animals of the control group received normal feed. In the animals of the former 3 groups, bilateral common carotid artery was clipped to develop the ischemia model, and then, blood reperfusion was performed to induce ischemic injury. Three weeks after gavage of rehmannia Yinzi, the levels of superoxide dismutase(SOD)and malondiadehyde(MDA)were detected in the brain tissue. Morris water maze experiment and platform-jump experiment were performed to detect the learning and memory capacity of the rats, and the area of infarction was measured as well.Results SOD level [(93.42±18.78) kU/g prot] in the model group was obviously lower than that of the normal control group [(158.36±22.32) kU/g prot], but MDA level [(6.35±2.04) μmol/g prot] was significantly higher than that of the control group, [(2.63±1.86) μmol/g prot], and statistical significance could be noticed, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The animal model was successfully developed. The SOD levels of group A [(135.34±20.12) kU/g prot] and group B [(132.78±19.56) kU/g prot] were significantly higher than those of the model group, and the MDA levels of group A [ (3.46±1.75) μmol/g prot] and group B [ (3.82±1.82) μmol/g prot] were significantly lower than those of the model group. Statistical significance could also be noted, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The rate of learning and memory errors, as well as latency were all significantly lower than those of the model group, and the latency of group A and group B were significantly shorter than that of the model group. Statistical significance could be found, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The areas of cerebral infarction in group A and group B were significantly smaller than that of the model group, and the area of cerebral infarction in group A was significantly smaller than that in group B, also with statistical significance(P<0.05).Conclusion Rehmannia Yinzi liquid could improve blood circulation in the damaged brain tissues, reduce the area of infarction, improve energy metabolism in the damaged brain, enhance suppressed nerve cells, repair nerve function defect, and also help to protect the damaged neurons.

Rehmannia Yinzi; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Protective effect

110032 沈阳，辽宁中医药大学附属医院

Q95-33

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.009

2016-04-08)