抗豪猪大肠埃希菌卵黄抗体的制备及抑菌性研究

张保平，李 娜，高惠林，王前光，任国冀，童学勤

(1.常德职业技术学院 农林工程系，湖南 常德 415000； 2.湖南文理学院 动物学湖南省高校重点实验室，湖南 常德 415000；3.湖南省桃源县堆金豪猪养殖基地，湖南 桃源 415000)

抗豪猪大肠埃希菌卵黄抗体的制备及抑菌性研究

张保平1，李 娜2*，高惠林1，王前光1，任国冀1，童学勤3

(1.常德职业技术学院 农林工程系，湖南 常德 415000； 2.湖南文理学院 动物学湖南省高校重点实验室，湖南 常德 415000；3.湖南省桃源县堆金豪猪养殖基地，湖南 桃源 415000)

本试验采用甲醛灭活仔豪猪腹泻大肠埃希菌作为免疫抗原，翅静脉注射免疫140日龄桃源蛋鸡，使机体免疫应答生成血清抗体和卵黄抗体，利用平板凝集试验检测抗体滴度，研究获得含高滴度血清和高免鸡蛋的最佳条件。结果表明，翅静脉注射大肠杆菌液最佳免疫剂量是每次1 mL，菌液浓度是1×1012mL-1。在大肠杆菌液中添加等剂量完全弗氏佐剂对免疫应答增强的程度最高。免疫强化程序能有效增强产蛋鸡的免疫应答强度，初免以后，每隔1天强化免疫1次，连续4次免疫，效果最好。体外抑菌性试验结果表明,制备的卵黄抗体对大肠埃希菌具有明显抑制其生长的作用，但是对沙门氏菌的抑制作用比较小。本研究制备的卵黄抗体滴度和血清抗体滴度变化幅度小、持续时间长、稳定性好，为临床上防治仔豪猪腹泻大肠埃希菌病提供新的手段。

大肠埃希菌； 豪猪； 卵黄抗体； 制备； 抑菌性

豪猪(porcupines)，又称箭猪、刺猪。在动物分类学上属于哺乳纲、啮齿目、豪猪科[1- 3]，是一种经济价值很高的珍稀动物，具有食用价值、药用价值和观赏价值[4- 5]。豪猪的抗病能力很强，很少发生疾病，仔豪猪腹泻是引起豪猪死亡的主要病因。

鸡卵黄抗体(IgY)是蛋鸡受免疫刺激后，鸡体内产生免疫应答，血液中免疫球蛋白G(IgG)被选择性地转移到卵黄中唯一的免疫球蛋白类[6]。与哺乳动物的IgG相比，鸡蛋的IgY具有取材方便、提取方法比较简单、产量高、稳定性较好等优点。可作为口服剂或饲料添加剂用于预防和治疗动物早期的消化道疾病[7]。

我国豪猪的养殖尚处于起步阶段,对豪猪的研究主要在繁殖、营养和生理等方面[8- 10]，有关豪猪疾病防治的研究报道较少。本研究以仔豪猪腹泻大肠埃希菌为抗原，筛选获得含有高效价抗豪猪大肠埃希菌卵黄抗体的免疫鸡蛋的最佳条件，并在体外研究抗仔豪猪大肠埃希菌卵黄抗体对大肠埃希菌和沙门氏菌生长的抑制作用,从而为大量制备特异性卵黄抗体防治仔豪猪大肠埃希菌腹泻病提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

纯种桃源蛋鸡，140日龄，购自桃源县良种场。试验期间试验鸡日常管理与卫生防疫按常规进行。

1.1.2 实验菌株

仔豪猪腹泻大肠埃希菌(E.coli)菌株和沙门氏菌(Salmonella)：常德职业技术学院农林工程系微生物实验室自行分离鉴定，并传代培养得到[11]。

1.1.3 主要试剂

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、氢氧化钠、磷酸二氢钠、甲醛、三氯甲烷、硫酸铵(分析纯)等，购自杭州微生物试剂有限公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂，购自北京鼎国昌盛生物有限责任公司；10号白油(食品级)、司班- 80、硬脂酸铝、磷酸氢钠(分析纯)等，购自上海化学试剂总厂；卡拉胶，低甲氧基果胶和氯化钙，购自天津市福辰化学试剂厂。

1.1.4 主要仪器

立式高压蒸汽灭菌锅，购自上海东亚压力容器制造公司；分光光度计、生化培养箱、干燥箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；电子天平，购自北京赛多利斯仪器有限公司；超净台，购自中国上海浦东物理光学仪器厂；医用血球计数板，购自江苏医用电子仪器公司；注射器，购自成都市双流双陆医疗器械公司；冰箱，购自青岛海尔公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基与免疫佐剂配制方法

牛肉膏蛋白胨培养基：按常规方法[12]制备，高压灭菌，置4 ℃冰箱中保存，备用。

白油佐剂：取96 mL 的10号白油放入烧杯中，文火加热，当温度达160 ℃以上时，边搅拌边加入56 ℃水浴中预热30 min的司班- 80 2 mL和硬脂酸铝4 g，当后者完全溶解，混合液呈透明胶冻状，小量分装，高压灭菌后4 ℃保存备用。

1.2.2 抗原制备

将仔豪猪腹泻大肠埃希菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37 ℃培养24 h，用无菌0.01 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS，pH 7.2)，小心冲洗菌苔，调成浓度为1×1012mL-1菌液，再加甲醛溶液至终浓度为0.4%，37 ℃灭活24 h。在此过程中每隔2 h摇匀一次。灭活完毕4 ℃保存。

取灭活的大肠埃希菌液分别与等量佐剂混合乳化。当溶液乳化至滴在水面上呈“油包水”状，即合格。否则继续乳化。3种佐剂(完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和白油佐剂)与灭活菌的乳化制备方法相同。4 ℃保存。

1.2.3 产蛋鸡免疫方案

桃源蛋鸡分组，每组6只，分两笼饲养。按照免疫抗原的不同剂量、不同佐剂种类和不同间隔时间等3种免疫强化方式分组。

不同剂量的免疫抗原：分3组，菌体浓度依次是1×1010、1×1012和1×1014mL-1。

不同佐剂依次是完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和10号白油3个组。

免疫强化方式分组，程序1：初免1次，无免疫强化。程序2：初免后每隔1 d免疫强化1次，连续4 次。程序3：初免后每隔2 d免疫强化1次，连续4 次。

1.2.4 高免卵黄抗体制备

收集未免疫鸡蛋，初次免疫接种当天记为0 d，以后每隔7 d收集免疫蛋作样本，依次编号记录，4 ℃保存。连续收集9次。同时设未免疫对照组，注射PBS乳化剂。

先将收集的鸡蛋用清水洗净，再喷洒0.1%新洁尔灭消毒，无菌收集卵黄。分离卵黄与等量PBS混匀，然后加4倍体积的脱脂溶液[13](含0.06%的卡拉胶，0.18%的低甲氧基果胶和10 μmol·L-1氯化钙)混匀，12 000 r·min-1、4 ℃离心25 min，取上清；再加硫酸铵至终浓度33%(m/V)，混匀，4 ℃ 1 h，12 000 r·min-1离心25 min，取沉淀用PBS溶解，加入硫酸铵至终浓度20%(m/V)，混匀，放于透析袋透析，无菌过滤后加0.01%硫柳汞和青链霉素1 000 IU·mL-1，小量分装，-20 ℃保存。

1.2.5 蛋鸡血清制备

免疫前1 d采血。免疫后每隔7 d，自鸡翅静脉采血1 mL。分离血清，3 500 r·min-1离心5 min除红细胞。标记，置-20 ℃冻存。连续采血9次。

1.2.6 抗体效价测定

采用平板凝集试验进行抗体效价测定。96孔“V”型微量血凝板中每孔加入灭菌生理盐水25 μL，再吸抗体25 μL加入第1孔中，混匀，吸混合液25 μL于第2孔，混匀，吸混合液25 μL于第3孔。依次倍比稀释至256倍(即第8孔，多余25 μL溶液吸弃)。留第9孔作空白对照，加灭菌生理盐水25 μL。每孔加仔豪猪腹泻E.coli抗原(含菌量为1×1012mL-1)25 μL，混匀各孔中溶液(每孔更换枪头)，微量血凝板放振荡器上震荡，2～3 min后，记录每孔凝集现象。对照孔溶液应为均匀浑浊。与对照孔中溶液一样浑浊者判定为无凝集反应，记为-。凡是孔中溶液有肉眼可见絮状凝集块者，判定为有凝集反应，记录为+。絮状凝集块愈多，阳性反应判定为愈强，分别用++、+++和++++表示。凡发生凝集反应结果判定为++的最高稀释度即是该样本抗体效价。效价用log2x(x为稀释倍数)表示。

1.2.7 卵黄抗体的抑菌性检测

以实验室自行分离保存的致病性大肠埃希菌和沙门氏菌作为实验菌株，进行体外抑菌性试验，具体试验操作参考文献[14]进行，并稍加改进。取3只试管，每只内装牛肉膏蛋白胨液体培养基8 mL。先在每个试管中加入大肠埃希菌指示菌悬液1 mL，再向其中2支试管各加入1 mL不同浓度的卵黄抗体，使卵黄抗体的最终浓度分别达到1 mg·mL-1和10 mg·mL-1。另外的1支试管中加入1 mL灭菌的生理盐水作为阴性对照。同样方法操作沙门氏菌。将6只试管放在37 ℃恒温培养箱中培养，分别在1、5、8、21、25和29 h各取1 mL培养液，用分光光度计在600 nm波长下测定各个检测样本的吸光度D值。

2 结果与分析

2.1 免疫菌液浓度对卵黄抗体效价和鸡血清抗体的影响

不同浓度(含菌数1×1010mL-1、1×1012mL-1和1×1014mL-1)的大肠杆菌悬浮液1 mL分别免疫蛋鸡，无佐剂，经翅静脉注射1次，免疫后特定时间收蛋和采血，测定卵黄抗体和血清抗体效价，结果如图1中A和B所示。

图1 抗原免疫菌液浓度对卵黄抗体(A)和鸡血清抗体(B)效价的影响

从图1中A看出，不同浓度菌液免疫的鸡蛋，其卵黄抗体的效价有较大差异。1×1010mL-1菌量免疫的鸡蛋卵黄抗体效价明显低于1×1012mL-1和1×1014mL-1菌量免疫的鸡蛋。但对1×1012mL-1和1×1014mL-1菌量免疫的鸡蛋卵黄抗体效价差别不明显。

从图1中B和A对比可知，同等条件下，被免疫鸡的血清抗体效价比卵黄抗体效价要略高一些。但就变化趋势看，卵黄抗体效价与血清抗体效价的变化规律基本相同，均呈先上升，再平稳，后下降的趋势，并且基本同步。因此，选择注射菌液浓度1×1012mL-1的大肠杆菌悬浮液1 mL作为最佳免疫剂量。

2.2 不同免疫佐剂对卵黄抗体和鸡血清抗体效价的影响

对蛋鸡注射菌液浓度是1×1012mL-1菌悬浮液1 mL，添加不同佐剂(完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和10号白油)，经翅静脉免疫注射1次，免疫后不同时间收蛋和采血测卵黄抗体和血清抗体效价。同时无佐剂免疫组同步免疫，作阴性对照。结果如图2中A和B所示。

图2 3种不同免疫佐剂对卵黄抗体(A)和鸡血清抗体(B)效价的影响

图2中A和B是3种免疫佐剂对卵黄抗体和鸡血清抗体效价的影响。研究发现，佐剂的添加均可在一定程度上提高卵黄抗体和血清抗体的效价。但从3种佐剂产生的免疫应答看，完全弗氏佐剂效果最好，不完全弗氏佐剂和白油佐剂效果略差，后两者对免疫应答的加强作用差异不明显。添加完全弗氏佐剂后，可使第6周收集的免疫蛋卵黄抗体效价从3log2上升到5log2，同时第6周采集的血清抗体效价从4log2上升至7log2，增加幅度明显。因此在制备免疫原时选择大肠埃希菌悬液与完全弗氏佐剂等量混合。

2.3 不同强化免疫程序对卵黄抗体和鸡血清抗体效价的影响

给蛋鸡免疫浓度是1×1012mL-1菌悬液1 mL，添加等量完全弗氏佐剂，经翅静脉注射，不同程序强化免疫，免疫后不同时间收蛋和采血，测卵黄抗体和血清抗体效价，结果如图3中A和B所示。

图3中A和B是不同强化免疫程序对卵黄抗体和血清抗体效价的影响。结果显示，与未进行免疫强化的程序1相比，两种免疫强化的程序2和3均可明显提高卵黄抗体和血清抗体效价。重要的是，在未进行免疫强化的鸡血清和卵黄中，其抗体效价分别在第8周和第9周明显下降，但免疫强化后，下降趋势或者被推迟出现或者被完全消除。对比3种免疫程序，发现程序2和3在效果上差异不明显，因此，为节约时间，可选择采用免疫强化程序2对蛋鸡免疫。

2.4 卵黄抗体的活性测定

2.4.1 卵黄抗体对大肠埃希菌的抑菌性测定结果

制备的卵黄抗体对大肠埃希菌在生长的早期具有明显的抑制作用,试验组和生理盐水对照组的D值具有明显差异,但是在24 h以后，卵黄抗体对大肠埃希菌的抑制作用下降。结果见图4中A。

2.4.2 卵黄抗体对沙门氏菌的抑菌性测定结果

制备的卵黄抗体对沙门氏菌在生长的过程中具有一定的抑制作用,但是较大肠杆菌小。结果见图4中B。

图3 免疫程序对卵黄抗体(A)和鸡血清抗体(B)效价的影响

图4 不同浓度的卵黄抗体对大肠埃希菌(A)和沙门氏杆菌(B)的抑菌作用

3 讨论

免疫蛋的制备，实质上是对蛋鸡进行抗原免疫，让其在血液中产生的抗体转化到蛋黄中贮藏而形成含有较高特异性抗体浓度的鸡蛋。研究显示，抗原进入机体要经过一个潜伏期才开始发生免疫作用，细菌抗原多是5～7 d。本研究结果表明，免疫初期，免疫组与对照组卵黄抗体效价和血清抗体效价均无明显差别，说明是处在免疫潜伏阶段。

动物在受到抗原刺激后，在免疫应答不同阶段所产生的抗体类别是有差异的。初次应答所产生的抗体水平不高，IgG很少，多数为IgM。但免疫加强后，抗体效价增高迅速，产生抗体则主要为IgG，而IgM很少。此现象的原因是记忆细胞开始重新分化、增殖，产生大量抗体。本文研究也印证了这一点，在免疫加强后，卵黄抗体和血清抗体效价均有大幅度升高现象。

以仔豪猪大肠埃希菌悬浮液对140日龄纯种桃源蛋鸡免疫时，若固定免疫抗原剂量为1 mL，则当菌液浓度低于1×1012mL-1时，免疫应答强度随免疫剂量的降低而降低；当菌液浓度高于1×1012mL-1时，免疫应答强度则不会随免疫剂量的增加而得到明显增强。据此确定免疫菌液浓度是1×1012mL-1，剂量定为每次1 mL。在菌悬液中分别添加等量完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和10号白油佐剂免疫蛋鸡时，均可明显加强鸡体免疫应答强度，其中完全弗氏佐剂对免疫应答加强的程度最高，且对受试动物无不良作用。初免后，每隔1 d强化免疫1次，连续4次的强化免疫程序既经济又有效。

体外抑菌性作用的试验结果表明，制备的卵黄抗体对大肠杆菌在生长的早期具有明显的抑制作用，试验组和生理盐水对照组的D值具有明显差异，但是在24 h以后，卵黄抗体对大肠杆菌的抑制作用下降。对沙门氏菌在生长的过程中具有一定的抑制作用,但是作用不是非常明显。

本文研究了仔豪猪腹泻大肠埃希菌高免卵黄抗体及免疫鸡血清抗体的变化规律，制备出了高效价的卵黄抗体和血清抗体。免疫后高效价卵黄抗体可以维持4周以上。试验结果为临床应用鸡源高效卵黄抗体防治仔豪猪大肠埃希菌腹泻病研究提供了技术依据和实验材料。

[1] 张荣祖. 中国哺乳动物分布[M]. 北京：中国林业出版社，1997：172.

[2] 王玉玺，张淑云. 中国兽类分布名录(四)[J]. 野生动物，1993，14(5)：10- 11.

[3] 王酉之，胡锦矗. 四川兽类原色图鉴[M]. 北京：中国林业出版社，1999：251.

[4] 彭孟德，张晓梅. 特种药用动物养殖与加工技术[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，1994：65- 68.

[5] 常祖光. 药用豪猪可大力养殖[J]. 农村实用科技信息，2005(9)：40.

[6] 王丽英，马美湖，黄群，等. 鸡卵黄免疫球蛋白的mPEG修饰及其稳定性研究[J]. 光谱学与光谱分析，2002，32(9)：2501- 2507.

[7] 彭玉麟，呙于明. 鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景[J]. 中国饲料，2002(6)：26- 28.

[8] 王前光，刘秋，张保平，等. 日粮消化能和蛋白质水平对6—8月龄豪猪生产性能的影响[J]. 西北农业学报, 2013，22(5)：204- 210.

[9] 姜卫星，李伟，唐松元，等. 不同公母配比对提高豪猪繁殖性能的影响[J]. 经济动物学报，2010，14(2)：84- 86.

[10] 刘军，阳水刚，宾冬梅，等. 豪猪雌性生殖器官的解剖研究[J]. 经济动物学报，2005，9(3)：140- 142.

[11] 张保平，李娜，高惠林，等. 豪猪致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 江苏农业科学，2014，42(9)：189- 190.

[12] 赵斌，林会. 微生物学实验[M]. 2版.北京：科学出版社，2014.

[13] TAN S H, MOHAMEDALI A, KAPUR A, et al. A novel, cost- effective and efficient chicken egg IgY purification procedure[J]. Journal of Immunological Methods, 2012, 380：73- 76.

[14] 闻平，俞晓丽，陈蕾，等. 黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性研究[J].抗感染药学，2007，4(4)：161- 163.

(责任编辑：卢福庄)

2016- 12- 18

国家星火计划项目“桃源豪猪健康养殖示范推广及产业化开发”(2015GA770010);湖南省教育厅科学研究项目(12C0974;14C0805); 湖南省常德市科技计划(2012CK03、2011CK01);湖南文理学院生科学院2016年省级平台开放科研项目(SKYPT201607)

张保平(1978—)，男，内蒙古人，讲师，硕士，从事预防兽医学研究工作，E- mail：bpzhang2007@126.com。

李 娜(1977—)，女，讲师，硕士，从事动物病原微生物与免疫学研究工作，E- mail：vetlina@126.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170339

S858.9；S852.4

A

0528- 9017(2017)03- 0484- 05

文献著录格式：张保平，李娜，高惠林，等. 抗豪猪大肠埃希菌卵黄抗体的制备及抑菌性研究[J].浙江农业科学，2017，58(3)：484- 488.