恩替卡韦治疗后e抗原阳性慢性乙型肝炎患者Treg/Th17比率的变化及其与疗效的关系

李成伟，卢丹，那妍，李岩，王本鑫，娄宪芝

（沈阳医学院附属中心医院1.感染科；2.呼吸科；3.检验科，沈阳110024）

恩替卡韦治疗后e抗原阳性慢性乙型肝炎患者Treg/Th17比率的变化及其与疗效的关系

李成伟1，卢丹2，那妍1，李岩1，王本鑫3，娄宪芝1

（沈阳医学院附属中心医院1.感染科；2.呼吸科；3.检验科，沈阳110024）

目的研究恩替卡韦治疗乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者过程中调节性T细胞（Treg）与Th17细胞比率的变化及其与病毒学应答和血清学应答的关系。方法应用恩替卡韦治疗27例HBeAg阳性CHB患者，在治疗前及治疗4、12、24、36、48周时分别检测乙肝标志物、HBV DNA、肝功、Treg细胞频数、Th17细胞频数。选择20名健康人作为对照组。结果Treg/Th17比率在第4周开始下降，至第12周达到最低值。发生早期病毒学应答及HBeAg消失患者的Treg/Th17比率（12周）低于未发生早期病毒学应答及HBeAg消失的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎患者过程中，Treg/Th17比率呈动态变化，12周时Treg/Th17比率与HBeAg消失、早期病毒学应答密切相关，可能成为疗效预测的指标。

慢性乙型肝炎；恩替卡韦；调节性T细胞；Th17细胞

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）仍是世界范围内亟待解决的严重公共卫生问题［1］，恩替卡韦为鸟嘌呤核苷类似物，是治疗CHB首选的药物之一，抗病毒治疗效果好，耐药率低。影响抗病毒疗效的因素主要包括宿主和病毒两方面因素，研究表明宿主的免疫状态是预测疗效的关键因素［2］，调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）与Th17细胞的比率可以反映CHB患者体内免疫状态的变化［3］。本研究探讨了恩替卡韦治疗CHB过程中Treg/Th17比率的变化与疗效的关系，并评价其临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2013年1月至2014年12月沈阳医学院附属中心医院感染科诊治的27例乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阳性CHB患者，平均年龄（38.7±12.2）岁，其中男17例，女10例，均符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2010）［4］的诊断标准，患者HBV DNA≥5 lg（copies/mL），HBeAg阳性，丙氨酸转移酶（alanine aminotransferase，ALT）≥2 ULN，至少半年内未进行抗病毒或免疫调节治疗。给予恩替卡韦（博路定）0.5 mg每日1次口服；肝功异常者给予保肝药物治疗。选择20名健康人（男10名，女10名）作为对照组，所有健康对照者排除自身免疫性肝病等肝脏疾病，排除人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒等病毒感染。

1.2 检测指标

CHB患者在应用恩替卡韦治疗前及治疗4、12、24、36、48周时采集外周静脉血，测定Treg细胞（Foxp3+T细胞）比例、Th17细胞（IL⁃17+T细胞）比例、HBV DNA水平（HBV DNA阴转标准为HBV DNA＜103copies/mL）、HBV血清标志物、ALT水平。健康对照组仅采血1次，测定Treg细胞（Foxp3+T细胞）和Th17细胞（IL⁃17+T细胞）比例。

1.3 方法

1.3.1 Th17细胞检测：实验前应用肝素抗凝管分别取实验组及对照组每人全血5 mL。取新试管孵育细胞，肝素抗凝全血500 μL，加刺激剂500 μL后放入37℃的CO2恒温箱中孵育5 h。再取一新试管，加入CD3、CD4抗体各10 μL，刺激后血样用移液器取上清500 μL弃去，混匀，取100 μL放入加好抗体的试管，放置15 min（室温避光）。加入1 mL溶血素（溶血素∶蒸馏水=1∶9）放置10 min（室温避光）。低速离心5 min（1 500 r/min）弃去上清。加入1 mL破膜液放置30 min（室温避光）。加入1 mL破膜buffer放置20 min（室温避光）。低速离心5 min（1 500 r/min）弃去上清。加17 μL IL⁃17抗体，混匀后放置30 min（室温避光）。加入1 mL PBS混匀后低速离心弃去上清。加300 μL PBS后混匀进行流式检测（美国BD Biosciences流式细胞仪）。

1.3.2 Treg细胞检测：另取新试管，加CD4抗体、CD25抗体各10 μL，加未孵育全血100 μL，混匀，放置15 min（室温避光）。加入1 mL破膜液，放置30 min（室温避光）。加入1 mL破膜buffer放置20 min（室温避光）。低速离心5 min（1 500 r/min）弃上清。加2.5 μL Foxp3抗体，放置2 h（室温避光）。加入PBS 1 mL，混匀，低速离心5 min（1 500 r/min）弃上清。加300 μL PBS，应用流式细胞仪（美国BD Bio⁃sciences流式细胞仪）进行检测。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，组间均值比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 恩替卡韦治疗前后Treg细胞和Th17细胞频数的变化

如表1所示，应用恩替卡韦治疗后，CHB组患者Treg细胞在第4周开始下降，至12周达到最低点，之后逐渐升高，至48周接近治疗前水平。CHB组患者Th17细胞频数的均数在各时间点均明显高于对照组（P＜0.05），CHB组患者Th17细胞频数先升高后下降，第12周改变最显著。CHB组患者Treg/Th17比率在治疗过程中呈动态变化，治疗4周时开始下降，至12周达到最低值，后逐渐升高，在48周时与治疗前水平相近。CHB组患者Treg/Th17比率在治疗前及治疗中各时间点均明显低于对照组（P＜0.05）。

表1 恩替卡韦治疗CHB患者Treg细胞和Th17细胞频数的变化Tab.1Changes of Treg/Th17 ratio in HBeAg positive CHB patients receiving entecavir

2.2 Treg/Th17比率变化与HBV DNA变化的相关性

27例HBeAg阳性的CHB患者应用恩替卡韦治疗后，HBV DNA于第4周时开始下降，12周时患者HBV DNA阴转率为62.96%（17/27），24周时患者HBV DNA阴转率为96.29%（26/27），48周时患者HBV DNA阴转率为100%（27/27）。

Treg/Th17比率在12周时改变最明显，分析12周时Treg/Th17比率与早期病毒学应答（12周）的关系，发生早期病毒学应答的17例患者Treg/Th17比率均数（1.79±0.62）较未发生病毒学早期应答的10例患者Treg/Th17比率均数（2.43±0.36）明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 Treg/Th17比率变化与HBeAg消失的关系

入组时所有患者均为HBeAg阳性，24周时HBeAg阴转率为11.11%（3/27），48周时累计HBeAg阴转率为37.04%（10/27）。发生HBeAg消失（12周）的10例患者Treg/th17比率（1.45±0.51）与未发生HBeAg消失的17例患者的Treg/th17比率（2.37± 0.37）的差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

HBV持续复制及机体的免疫反应是CHB进展的重要原因［5］，持续抑制病毒是治疗CHB的重要措施，恩替卡韦具有强效抗HBV作用，经治疗患者HBV DNA载量迅速下降，并且在治疗过程中表现出较高的HBeAg清除率，而Treg/Th17比率可以提示患者体内免疫功能的变化，研究Treg/Th17比率与HBeAg清除的关系对指导临床治疗有重要意义。

Treg细胞是以免疫抑制活性为特征的T细胞，可抑制HBV特异性免疫反应，是导致免疫耐受的主要细胞［6］。而且HBV能够诱导Treg的产生，维持免疫耐受［7］。核苷（酸）类似物治疗可能使刺激Treg细胞增多的因素减少，Treg细胞比例明显降低，抑制HBV特异性免疫反应的作用减弱，体内免疫反应增强，免疫功能得到改善。Th17细胞产生的白细胞介素17A等效应因子可增强组织炎症反应，有研究［8］表明免疫介导的肝脏损伤与Th17细胞相关，考虑为Th17细胞表达增加，增强和参与了因HBV特异性免疫应答而引起的肝脏炎症反应。Treg细胞抑制炎症反应，而Th17细胞促进炎症反应，Treg/Th17的动态平衡是慢性炎症持续及进展等变化的重要因素［9］。CHB患者多处于Th17细胞增加的免疫失衡状态，Treg/Th17比率可以提示患者体内免疫功能的变化［10］。

本研究中，经恩替卡韦治疗后，Treg/Th17比率呈现动态变化，表现为先下降后升高，且CHB患者的Th17细胞在各个时间点均明显高于健康对照者，导致Treg/Th17比率降低，各个时间点均低于健康对照者。恩替卡韦治疗使HBV DNA载量迅速降低，改善了机体免疫状态，使Th17细胞增多，Treg/Th17比率降低。而后Treg/Th17比率逐渐升高的机制可能为体内免疫系统为减轻炎症反应，使CD4+T细胞向Treg细胞分化［11］，从而Th17细胞减少。也有研究［12］表明，当HBV DNA明显下降、HBeAg转阴或发生血清学转换及ALT恢复正常时，Th17细胞及其相关细胞因子的分泌均呈明显下降趋势，Treg细胞与Th17细胞进入新的平衡状态，Treg/Th17比率升高。本研究观察到，第12周时Treg/Th17比率的变化在早期病毒学应答及HBeAg消失的患者中表现更明显，差异有统计学意义，提示Treg/Th17比率的变化与早期病毒学应答及HBeAg消失相关。

Treg/Th17比率在接受恩替卡韦治疗的HBeAg阳性CHB患者中呈波动性改变，与疗效具有相关性，但其波动机制及预测疗效的作用及程度还需要进一步观察。

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（编辑陈姜）

Relationship between Changes of Treg/Th17 Ratio and Curative Effect in Patients with HBeAg⁃positive Chronic Hepatitis B after Receiving Entecavir

LI Chengwei1，LU Dan2，NA Yan1，LI Yan1，WANG Benxin3，LOU Xianzhi1
（1.Department of Infectious Disease，The Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；2.Department of Respiration，The Affili⁃ated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China；3.Clinical Laboratory，The Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate whether there are correlation among changes of Treg/Th17 ratio with virological response and serological re⁃sponse in patients with hepatitis B e antigen（HBeAg）⁃positive chronic hepatitis B（CHB）after receiving entecavir.Methods27 patients with HBeAg⁃positive CHB were enrolled for the study.Peripheral blood Treg cell frequency and Th17 cell frequency，HBV DNA，alanine aminotransfer⁃ase levels，hepatitis B virus marker were detected before and after entecavir treatment at 4，12，24，36，and 48 weeks.Peripheral blood Treg cell frequency and Th17 cell frequency of 20 healthy volunteers were detected as well.ResultsTreg/Th17 ratio of patients decreased from 4 week and reached the lowest point at 12 weeks.Treg/Th17 ratio（12 weeks）of the patients who got the early virological response and HBeAg disappeared was lower than others，and the difference was statistical significant.ConclusionTreg/Th17 ratio changes in HBeAg⁃positive CHB patients receiv⁃ing entecavir antiviral treatment.Treg/Th17 ratio（12 weeks）showed significant correlation with early virological response and HBeAg disappear⁃ance.The changes of Treg/Th17 ratio may provide a reference of curative effect.

chronic hepatitis B；entecavir；T regulatory cell；Th17 cell

R512.6

A

0258-4646（2017）01-0033-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.01.007

辽宁省科学技术计划（2013225086）；沈阳市卫生局科研课题（2012）

李成伟（1975-），男，副主任医师，硕士.

娄宪芝，E-mail：grk8@163.com

2016-05-19

网络出版时间：