小鼠SPINK5基因重组过表达腺病毒载体构建及其对特应性皮炎小鼠模型皮损疗效的研究

2017-04-18狄正鸿许静侯殿东纪莲刘晓梅孙鲁宁

中国医科大学学报 2017年1期

狄正鸿，许静，侯殿东，纪莲，刘晓梅，孙鲁宁

（中国医科大学1.附属盛京医院皮肤科，沈阳110004；2.附属第一医院皮肤科，沈阳110001；3.附属盛京医院实验中心，沈阳110004；4.基础医学院病理生理学教研室，沈阳110122）

狄正鸿1，许静1，侯殿东2，纪莲3，刘晓梅3，孙鲁宁4

目的构建表达小鼠SPINK5基因的重组腺病毒载体，观察其对特应性皮炎小鼠模型的治疗效果。方法采用DNA重组技术，将携带小鼠SPINK5基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，产生重组腺病毒。采用卵清蛋白，通过腹腔，皮下注射系统致敏结合皮肤局部外涂局部致敏Balb/c小鼠，建立特应性皮炎小鼠模型。将携带SPINK5基因的腺病毒载体注射至特应性皮炎小鼠模型皮损内，观测其对特应性皮炎小鼠模型的治疗效应。结果成功构建了表达小鼠SPINK5基因的重组腺病毒载体及小鼠特应性皮炎模型，该病毒载体注射于特应性皮炎小鼠模型皮损内，治疗2周可明显减轻皮损处潮红，水肿及炎性反应。皮损处病理检测显示，与模型对照相比较，皮损厚度，炎性细胞浸润明显改善。结论SPINK5基因治疗对特应性皮炎小鼠模型具有明显的治疗效果。SPINK5基因产物局部外用有望用于特应性皮炎的治疗。

SPINK5基因；重组腺病毒载体；特应性皮炎；小鼠模型

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种好发于婴幼儿并可延续至成人的慢性瘙痒性皮肤病，生命早期患有AD可进一步启动特应性进程，引发哮喘、过敏性鼻炎等其他过敏性疾病。近年来AD的发病率在全球呈迅速上升趋势，可累及20%的儿童及3%的成人［1］。AD发病与皮肤屏障功能障碍密切相关，丝聚合蛋白（filaggrin，FLG）是维持皮肤屏障结构及功能完整性的关键蛋白［2］。而由丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 5型基因（serine protease inhibitor Ka⁃zal type 5，SPINK5）编码的淋巴上皮Kazal型相关抑制剂（lympho⁃epithelial Kazal⁃type⁃related inhibitor，LEKTI）是FLG正常表达代谢的重要调控通路［3］。既往研究［4］表明AD急性及慢性皮损中FLG及LEK⁃TI表达均明显下降，AD异常免疫反应模式可降低体外培养的人角质形成细胞LEKTI的表达，增强包括丝氨酸蛋白酶在内的多种蛋白酶的表达，从而干扰FLG表达，显示了LEKTI在AD发病中具有保护作用。本研究拟构建表达小鼠LEKTI的腺病毒载体，将携带小鼠SPINK5基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染HEK293细胞，通过Cre/loxP重组酶系统的作用产生重组腺病毒。构建小鼠AD模型，并观察SPINK5基因重组过表达腺病毒对小鼠AD模型皮损的疗效，为进一步用于人类研究建立理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

6周龄Balb/c雌性小鼠（北京华阜康公司），腺病毒载体GV314（CMV⁃MCS⁃3FLAG⁃SV40⁃EGFP，克隆位点BamHⅠ/AgeⅠ，吉凯基因化学技术有限公司），大肠杆菌菌株DH5α（吉凯基因化学技术有限公司），限制性内切酶BamHⅠ、AgeⅠ（美国NEB公司），HEK293细胞（美国ATCC公司），辅助包装质粒PBHG（中国Microbix公司），In⁃Fusion™PCR Clon⁃ing Kit（美国Clontech公司），Taq聚合酶（中国Sino⁃Bio公司），Plasmid抽提Kit（美国Promega公司），EndoFree midi Plasmid Kit（中国Tiangen公司），胎牛血清FBS（美国GIB公司），DMEM培养基（美国GIB公司），LB液体培养基（美国ATCC公司），Lipo⁃fectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen公司），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），Adeno⁃X™Virus Purification Kit（BD Biosciences，美国Clontech公司），明矾、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美国Sigma公司），引物由上海捷瑞生物合成，测序由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠SPINK5基因克隆及过表达腺病毒载体构建：根据小鼠SPINK5（NM⁃001081180）基因cDNA的序列，设计合成含有同源重组序列及酶切位点的扩增引物序列：SPINK5⁃P1，AGGTCGACTCTAGAG GATCCCGCCACCATGAAGACAGCCACGGTGCCAA TGCTTCTG；SPINK5⁃P2，CCTTGTAGTCCATACCG GTTTGCATCATTTTTTCAGATGCAGGTGTGCC。

PCR反应扩增SPINK5DNA片段，50 μL反应体系如下：ddH2O 32.5 μL；5×PS Buffer 10 μL；dNTP Mix 4 μL；上下游扩增引物（10 μmol）各1 μL；模板（10 ng/μL），1 μL；PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL。利用限制性内切酶BamHⅠ，AgeⅠ消化腺病毒载体GV314获得线性化载体，参照GV314载体说明书构建反应体系，完成GV314线性载体与SPINK5基因片段的环化。将此重组产物加入到含有大肠杆菌DH5α的LB液体培养基菌液中，在培养板上恒温37℃培养12 h。取其单克隆菌落进行PCR鉴定。鉴定引物序列如下：P1，AAACAAACAAGAGC GATAAGG；P2，CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，对阳性克隆进行测序。在LB液体培养基中，37℃扩大培养测序正确的菌液。按照天根无内毒素质粒试剂盒操作步骤进行质粒抽提，用于下游病毒包装。

1.2.2 腺病毒包装与滴度检测：采用AdMax腺病毒包装系统，将含有SPINK5基因的GV314载体重组产物，辅助包装质粒PBHG（该质粒含有Cre/loxP重组酶系统）加入Lipofectamine 2000稀释混合形成DNA/Lipofectamine2000转染复合物；将此转染复合液滴加至HEK293细胞培养液中，利用Cre⁃loxP重组酶切割系统，产生携带SPINK5基因的重组腺病毒载体。转染后15 d，待50%HEK 293细胞脱壁飘落，细胞显示典型细胞病变效应，离心收集细胞并重悬于DMEM液中，-70℃/37℃反复冻融3次，离心收集病毒上清，采用终点稀释法进行滴度测定，于-70℃保存。

1.2.3 特应性皮炎小鼠模型建立：采用6周龄Balb/c雌性小鼠，改良OVA致敏方法［5⁃6］。（1）第1天（系统致敏）：小鼠腹腔内注射200 μg/mL OVA溶液0.5 mL（含5%明矾佐剂）。（2）第6天（系统致敏）：小鼠背部皮下注射100 μg/mL OVA溶液0.5 mL。（3）第18天（第1次局部致敏）：7%水合氯醛，1 mL腹腔注射麻醉后，剃除背部毛发，用毛刷反复刺激背部皮肤，使之有微小均匀裂口。取1 000 μg/mL OVA溶液100 μL置于1 cm2无菌纱布上，贴于小鼠背部皮肤，采用保鲜膜覆盖药布防止药物挥发，外缠黏性弹力绷带，每天更换，持续1周。（4）第39天（第2次局部致敏）：重复第18天局部OVA给药方法，持续1周。（5）第60天（第3次局部致敏）：重复第18天局部OVA给药方法，持续1周。

1.2.4 AD小鼠模型皮损内注射SPINK5腺病毒过表达载体：皮损处皮内注射病毒载体，每只病毒质粒总量3.5×108PFU，分多点均匀注射，注射间距0.5 cm。观测其对AD小鼠模型的疗效。分组：正常对照组、模型空白对照组、模型10 d空白对照组、模型17 d空白对照组、SPINK5腺病毒过表达载体皮损内局部注射后10 d组、SPINK5腺病毒过表达载体皮损内局部注射后17 d组，每组3只。

1.2.5 皮损变化及不良反应评价：分别于上述分组时间评价皮损变化，皮肤取材，记录皮损外观变化，皮损组织病理HE染色，光学显微镜下观察皮损处厚度及炎症细胞浸润强度。评价SPINK5腺病毒过表达载体对AD小鼠模型的大体及组织病理学影响。观察皮内注射病毒载体后小鼠活动、饮食及体质量变化。

2 结果

2.1 SPINK5基因的克隆合成

成功克隆合成小鼠SPINK5基因片段，该DNA片段长度为3 095 bp。PCR产物经1%琼脂糖电泳可清晰显示，见图1。

2.2 SPINK5基因腺病毒载体构建及测定结果

图1 克隆合成小鼠SPINK5基因DNA片段Fig.1PCR produce fragment of mice SPINK5 gene

GV314载体与SPINK5基因片段环化后，在含有大肠杆菌DH5α的培养液中培养，将获得的单克隆菌落经PCR鉴定，鉴定产物经1%琼脂糖电泳，可见到小鼠SPINK5基因1、2、3、5、7、8号转化子清晰表达，见图2。

2.3 SPINK5基因重组腺病毒包装及病毒浓度测定

图2 经琼脂糖电泳鉴定GV314线性载体与SPINK5基因片段重组产物Fig.2Agarose electrophoresis of recombination product of GV314 and mouse SPINK5 gene sequence

SPINK5基因重组腺病毒载体转染HEK293细胞36 h，细胞内即可观察到明显的荧光信号，表明目的质粒转染及荧光标记基因表达正常，见图3。浓缩收集病毒质粒经检测浓度为1E+10 PFU/mL

2.4 AD小鼠模型构建

经系统及局部致敏过程后，小鼠在第1次局部激发致敏后具有明显搔抓行为，背部可出现明显红斑渗出结痂，第2、3次局部激发致敏后背部皮肤逐渐增厚，局部潮红，伴有脱屑，皮损可持续存在3～4周。表现为从急性皮损逐渐向慢性皮损的演变的过程。正常对照小鼠及AD模型小鼠背部皮损情况见图4A、4B。

2.5 AD小鼠模型经皮损内注射SPINK5腺病毒过表达载体后皮损变化（图4）

经皮损内注射SPINK5腺病毒过表达载体后10 d、17 d，与模型空白对照比较，使用腺病毒载体小鼠体质量无明显改变，未见局部破溃红肿等不良反应，饮食活动未见明显改变，治疗组与对照组比较体质量未见明显差异。皮损局部潮红明显减轻，皮损厚度变薄。皮损处组织病理HE染色下观察AD小鼠模型可见表皮细胞增厚，细胞间水肿，真皮内淋巴细胞及嗜酸性粒细胞明显浸润。经皮损内注射SPINK5腺病毒1～2周后，与模型对照比较皮损处厚度明显减小，浸润炎性细胞数目明显减少，见图5。

图3 SPINK5基因重组腺病毒载体转染HEK293细胞×200Fig.3HEK 293 cells transformed with recombinant adenovirus vector containing mouse SPINK5 gene×200

图4 AD小鼠模型皮损内注射SPINK5基因腺病毒过表达载体治疗后皮损局部改变Fig.4The effect of SPINK5 gene recombinant adenovirus on the lesions of atopic dermatitis mice model

3 讨论

目前，AD皮损处外用药治疗以糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂为主。糖皮质类固醇激素具有导致皮肤萎缩，毛细血管扩张，色素改变等不良反应；钙调磷酸酶抑制剂长期外用具有潜在的致癌风险，因而不能长期使用。FLG蛋白是维持皮肤正常屏障结构及功能的关键性蛋白。LEKTI在表皮分化的过程中通过抑制性调节Matriptase、CAP1、caspase14、SCCE、SCTE等多种蛋白酶的活性而参与FLG代谢及皮肤屏障功能的维持与平衡的多个环节。LEKTI主要通过抑制Matriptase、CAP1、caspase14而抑制FLG的过度降解；还可通过抑制SCCE、SCTE活性而阻止角质形成细胞（keratinocyte，KC）过早成熟所导致的过度脱屑，因此，LEKTI是维持表皮屏障及皮肤外观的关键性蛋白酶［7］。LEKTI低表达可继发SC⁃CE、SCTE酶活性增高，加重炎症反应及过度脱屑，典型病例是在基因缺陷性皮肤病Netherton综合征中，由LEKTI蛋白编码基因SPINK5缺陷导致AD样皮损及皮肤过度脱屑，套叠性脆发症［8］。研究［4］表明AD皮损中FLG表达普遍下降，并伴有多种蛋白酶表达增高，而LEKTI表达明显下降。近年的研究［9］表明SPINK5也是AD的易感基因之一，AD患者皮损中LEKTI及SPs表达普遍异常，但SPINK5基因的无义变异在AD患者中并非普遍存在。尽管FLG异常表达是AD的重要发病机制，然而由于ProFLG是400×103的超大分子量蛋白，包含10～12个高度相似，但又有细微差别的FLG重复片段，且在不同种族中存在遗传异质性等特征，因此针对FLG进行基因治疗目前尚难以实现。而LEKTI作为FLG表达代谢的核心性调控蛋白，结构简单，是适合基因治疗的理想分子。最近，有研究［10］表明人SPINK5基因重组腺病毒可增高Netherton综合征患者体外培养的KC细胞SPINK5 mRNA的表达。显示LEKTI在AD治疗方面具有令人期待的药用前景。目前缺乏SPINK5持续表达的载体，并且对人体的其他影响不明，因此需要一个持续表达的LEKTI蛋白系统。

图5 HE染色显示皮损内注射SPINK5腺病毒过表达载体对AD小鼠模型的疗效×200Fig.5HE staining of AD mice model with SPINK5 gene recombinant adenovirus×200

OVA致敏小鼠AD模型是目前广泛应用的AD小鼠模型之一，其外周血免疫细胞及细胞因子，皮损局部病理及免疫反应与AD患者复合度高。其皮损处IL⁃4、IL⁃5增高，IFN⁃γ随病程延长而增高，呈现出由Th2向Th1型Th2型混合免疫反应转化，类似于AD慢性皮损［5⁃6］。笔者通过改良的OVA致敏方法建立小鼠AD动物模型，造模成功率高，临床及病理显示了从急性皮损逐渐向慢性皮损演变的过程。

本研究构建了SPINK5基因表达腺病毒载体，腺病毒载体对非分裂期及分裂期细胞均具感染力，其通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，可将腺病毒基因转移至细胞核内染色体外，但不整合入宿主细胞基因组，是目前较为安全的基因治疗载体。本研究结果表明小鼠皮损内注射整合了SPINK5基因的腺病毒载体，小鼠饮食睡眠正常，无体质量下降、死亡等表现。皮损内注射SPINK5基因表达腺病毒质粒后与模型对照比较，治疗2周可明显减轻皮损处潮红、水肿及炎症反应。皮损处病理与模型对照比较，皮损厚度、炎症细胞浸润明显改善。

LEKTI分子量相对较小，皮肤外用基因治疗具有基因导入方便，剂量易于调控等特点，推测蛋白酶抑制剂LEKTI有望成为未来AD药物治疗的重要靶点，局部使用LEKTI生物活性片段具有高度药理前途，开发LEKTI类药物有望经AD治疗带来新的突破。

［1］NUTTEN S.Atopic dermatitis：global epidemiology and risk factors［J］.Ann Nutr Metab，2015，66（Suppl 1）：8-16.DOI：10.1159/ 000370220.

［2］THYSSEN JP，KEZIC S.Causes of epidermal filaggrin reduction and their role in the pathogenesis of atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2014，134（4）：792-799.DOI：10.1016/j.ja⁃ci.2014.06.014.

［3］O’REGAN GM，SANDILANDS A，MCLEAN WH，et al.Filaggrinin atopic dermatitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，122（4）：689-693.DOI：10.1016/j.jaci.2008.08.002.

［4］DI ZH，MA L，QI RQ，et al.T helper 1 and T helper 2 cytokines dif⁃ferentially modulate expression of filaggrin and its processing prote⁃ases in human keratinocytes［J］.Chin Med J（Engl），2016，129（2）：295-303.DOI：10.4103/0366⁃6999.174489.

［5］SPERGEL J，MIZOGUCHI E，BREWER J，et al.Epicutaneous sen⁃sitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to metacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice［J］.Clin Invest，1998，101（8）：1614-1622.DOI：10.1172/JCI1647.

［6］YATSUZUKA R，INOUE T，JIANG S，et al.Development of new atopic dermatitis models characterized by not only itching but also inflammatory skin in mice［J］.Eur J Pharmacol，2007，565（1/3）：225-231.DOI：10.1016/j.ejphar.2007.02.062.

［7］MEYER⁃HOFFERT U.Reddish，scaly，and itchy：how proteases and their inhibitors contribute to inflammatory skin diseases［J］. Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2009，57（5）：345-354.DOI：10.1007/s00005⁃009⁃0045⁃6.

［8］D’ALESSIO M，FORTUGNO P，ZAMBRUNO G，et al.Netherton syndrome and its multifaceted defective protein LEKTI［J］.G Ital Dermatol Venereol，2013，148（1）：37-51.

［9］ZHAO LP，DI Z，ZHANG L，et al.Association ofSPINK5gene poly⁃morphisms with atopic dermatitis in Northeast China［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2012，26（5）：572-577.DOI：10.1111/ j.1468⁃3083.2011.04120.x.

［10］ROEDL D，OJI V，BUTERS JT，et al.rAAV2⁃mediated restoration of LEKTI in LEKTI⁃deficient cells from Netherton patients［J］.J Dermatol Sci，2011，61（3）：194-198.DOI：10.1016/j.jderms⁃ci.2010.12.004.

（编辑武玉欣）

Construction of Recombinant Adenovirus Vector Expressing Mouse SPINK5 Gene and Its Curative Effect on Skin Lesions in Atopic Dermatitis Mice

DI Zhenghong1，XU Jing1，HOU Diandong2，JI Lian3，LIU Xiaomei3，SUN Luning4
（1.Department of Dermatology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Dermatology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Experiment Center，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；4.Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo construct a recombinant adenovirus vector expressing mouseSPINK5gene，and observe its curative effect on the skin lesions in atopic dermatitis mice model.MethodsBy recombining DNA technology，the sequence of mouseSPINK5gene was cloned into adeno⁃virus shuttle plasmid.Then it was transformed into HEK 293 cells with the adenoviral backbone plasmid to obtain the recombinant adenovirus.A mouse model of atopic dermatitis was established by system and local sensitization of Balb/c mice with ovalbumin.The effect of recombinant adeno⁃virus on the lesions of atopic dermatitis mice model was observed.ResultsTheSPINK5over⁃expressing adenovirus vector and atopic dermatitis mice model were successfully constructed.After 2 weeks of adenovirus⁃mediatedSPINK5gene intracutaneous injection，the redness and edema of lesions of AD model mice were obvious relieved.The pathological detection indicated that epidermal thickness and prickle cell layer，inflammatory cell infiltration significant decreased accompanied with the model blank control.ConclusionThe adenovirus⁃mediatedSPINK5gene had signifi⁃cant therapeutic effect to the atopic dermatitis mice model，which provided a laboratory basis of application ofSPINK5gene product to therapy atopic dermatitis.

SPINK5gene；recombinant adenovirus vector；atopic dermatitis；mice model

R751.05

0258-4646（2017）01-0011-06

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2017.01.003

国家自然科学基金（81301366）；辽宁省自然科学基金（2013021004，2014021056）

狄正鸿（1973-），女，副教授，博士. E-mail：dizh2005@163.com

2016-05-07

网络出版时间：