气道内干预在大鼠支气管肺发育不良模型的应用

林玉芳 封志纯

气道内干预在大鼠支气管肺发育不良模型的应用

林玉芳 封志纯

目的 探索一种简便可行的气道内干预方式，应用到动物支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)模型。方法 新生1d Sprague-Dawley大鼠24只平均分为两组，一组为空气对照组，一组置于75%氧环境建立高氧诱导新生鼠BPD模型。于生后14d建模成功后，脱离氧环境，两组均采用自制气管插管，经声门气管插管方式，气道内给予2 μL/g 生理盐水，观察两组新生鼠体重、气管插管时间、干预后一周新生鼠存活率，新生鼠活力，并于生后21d处死，取肺组织行HE染色，观察其结构形态学变化。结果 氧诱导BPD模型建立后，高氧组新生大鼠体重低于空气对照组，所需插管时间高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且体重越大，所需插管时间越短(r=-0.719，P<0.05)，高氧组新生鼠一周后存活率低于对照组(83.3% vs 100%)，但均高于80%。高氧组新生鼠活力较对照组差，HE染色提示对照组肺组织结构无明显异常，高氧组出现肺结构损害，肺泡数目下降。结论 经声门气管插管，气道内给予2 μL/g干预体积的干预方式，简单易行，所需成本较低，干预后新生鼠存活率高，可以推广应用到需气道内给药的动物实验研究。

高氧；新生大鼠；气管插管；支气管肺发育不良

气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早产儿常见慢性呼吸系统疾病，其发病机制尚不明确，且随着产前糖皮质激素应用、产后使用肺表面活性物质、机械通气方式改进及早产儿营养支持，早产儿BPD发生率呈逐年增高趋势[1]。考虑BPD是肺部局部病变，关于其治疗的相关研究，宜于采用气管插管，气道内干预方法。动物实验中，由于老鼠繁殖快，成本低，易于饲养等特点，被广泛应用于基础研究。气管插管机械通气的方式，已较多应用于老鼠的心梗模型及需气道内干预等的相关研究中[2-3]。本实验，通过75%氧诱导新生SD大鼠BPD模型[4-5]，采用自制气管插管，通过经声门气管插管的方式，探索2 μL/g干预体积在新生大鼠BPD模型应用中的可行性。

资料与方法

一、实验动物及分组

清洁级健康SD孕鼠2只(购自北京华阜康生物科技有限公司),足月分娩后收集不同窝别鼠仔24只，混合后随机重新分窝，一组为空气对照组，一组为75%氧诱导BPD模型组，两组出生体重差异无统计学意义(P>0.05)。

二、动物BPD模型建立

自制塑料容器 60cm×45cm×25cm为氧箱，容器内设有 3 个不同孔区，一个是进气孔，另一个是由多个小孔组成的出气孔，第三孔与测氧仪(KY-2F型控氧仪，浙江省建德市新安江分析仪器二厂)相连。容器内放入钠石灰以吸附二氧化碳，箱内温度 22-30℃，湿度 65%-75%。空气对照组将1d新生SD大鼠置于常规饲养环境中，高氧组将1d新生SD大鼠置于氧箱中，持续输入氧气，氧流量为1L/min 左右，维持氧浓度75%，持续 14d, 测氧仪每日监测3次，每天定时开箱 1h，添加水和饲料，更换垫料钠石灰。

三、气管插管的构建及插管方法

考虑新生鼠体重较小，声门较窄，本实验采用9号腰椎穿刺针(扬州市江洲医疗器械有限公司)，将针芯抽出，尖端截短磨钝，并套上24G静脉留置针软套管(江苏苏云医疗器材有限公司)，构建成新生大鼠专用气管插管。将高氧组新生大鼠于生后14d脱离氧环境，两组均称重，考虑啮齿类动物对急性缺氧的耐受性较低,对麻醉所致呼吸抑制作用比较敏感,麻醉过深易造成实验动物发生呼吸抑制,如不能尽快完成气管插管极易致实验动物死亡，麻醉过浅则可能在插管过程中造成强烈应激,如肢体扭动、呼吸节律紊乱、声门关闭等。强行插管易造成口咽部水肿、声带损伤、喉痉挛、会厌或上气道出血等并发症,严重影响实验动物生理状态,干扰拔管后进食时间,影响实验结果的准确性，即掌握合适的麻醉深度是成功完成气管插管的前提。本实验采用腹腔注射10%水合氯醛(北京军区总医院制剂中心)3mL/kg，注射后3min左右，新生大鼠出现肌张力减弱，牵拉舌体无明显抵抗。将新生鼠腹部朝上，四肢固定于自制操作台上，并用细丝线固定上门牙，以防止头部活动，将操作台平面固定与地面成45°角，在操作台上方放置一冷光源。测定大鼠门齿据其上肢端距离作为气管插管深度，并在自制插管上做相应标记，左手的拇指和食指将新生鼠舌头轻轻拉向左侧，使用小号挖耳勺将舌根轻轻抬起，大鼠颈部在冷光源照射下，肉眼可看到舌根附近一透亮区域，使用自制的气管插管轻轻拨动该区域，即可看到声门口一张一合，在新生鼠吸气瞬间，将气管插管轻轻插入，插入深度以插管上标记作为参考。

四、插管正确性判断及干预物体积选择

新生小鼠安静状态下以腹式呼吸为主，气管插管经过声门时，新生鼠会出现一定刺激反应，操作者能感受到插管阻力稍增大，存在一定摩擦感，当插管进入气道后，新生鼠呼吸转为胸式呼吸，且将置于-20°冰箱预冷2min的镜子光面，置于气管插管口，可观察到圆形雾气形成(预冷时间不宜过长，防止脱离低温，镜子光面即形成一层水雾)，将一细小纤毛放置在导管口处,亦可见纤毛随呼吸摆动。而气管插管滑入食道，则无上述现象。考虑气道内干预物体积过大，容易导致窒息，参照相关文献，本实验采用气道内给予2 μL/g生理盐水[6]，并追加50 μL左右空气，利于生理盐水在气道分布。

五、实验标本的采集

两组新生大鼠均于生后21d，腹腔注射10%水合氯醛(8mL/Kg)处死，快速剪开胸腔，取出左侧肺脏，生理盐水冲洗后，浸于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，常规5μm切片，苏木素 - 伊红(HE)染色进行肺组织形态(光镜)观察。

六、观察指标

新生鼠入组时的体重及造模后体重，气管插管时间，插管一周后存活率，体重与插管时间相关性，并观察两组新生鼠的活力和肺组织结构方面的差异。

七、统计学处理

实验结果

一、新生鼠体重、插管时间、插管存活率及体重和插管时间相关性

入组时空气组新生鼠体重和高氧组差异无统计学意义(7.40±0.43 vs 7.44±0.31，P>0.05),生后14d空气组新生鼠体重高于高氧组，差异有统计学意义(28.54±1.63 vs 18.42±1.59，P<0.05)。空气组插管时间低于高氧组，差异有统计学意义(37.90±7.57 vs 47.89±6.27，P<0.05)。空气组干预后1周存活率100%，高氧组干预后一周内，死亡1只，存活率83.8%。插管时间和体重存在一定负相关，体重越大，所需插管时间越短。(见表1，图1)。

表1 两组新生鼠体重及插管时间的比较±s)

注：aP<0.05，与空气对照组相比，差异具有统计学意义

二、新生鼠活力及肺组织结构

入组时两组新生鼠活力无明显差异，高氧组生后14d，新生鼠表现为毛发蓬松、粗糙，光泽差；活力下降，反应明显变差，少动不活泼，体格较对照组明显较小。且脱离氧环境一周后(生后21d)，仍可观察到高氧组鼠体格较空气组小，活力较空气组稍差。21d处死后，肺组织HE染色观察到，空气组生理盐水干预后，肺组织结构无明显异常改变，肺泡结构清楚，肺泡腔较小，肺泡数目较多，肺泡间隔较厚；高氧组肺泡均呈不规则改变，腔隙较大，部分肺泡融合，整体数量减少(见图2)。

图1 插管时间与新生鼠体重散点图

注：横轴代表新生鼠体重(单位g)，纵轴代表插管时间(单位s)，二者pearson线性相关分析r=-0.719，P=0.000，体重越小，所需插管时间越长

图2 肺组织HE染色(100×)

注：空气组无明显肺损伤，肺泡结构清楚，肺泡腔较小，肺泡数目较多，肺泡间隔较厚；高氧组肺组织结构紊乱，肺泡壁较薄，肺泡大小不均，数目明显减少，肺泡腔直径明显增大

讨 论

采用经声门气管插管，气道内给予2 μL/g干预体积，干预后动物存活率高，且无肺水肿、肺出血等不良反应。体积小的动物气管较细,声门较窄，气管插管的方法严重影响小鼠成活率。气管切开法存在损伤较大,通常发生气管塌陷、气管切口出血、分泌物增多引起小鼠窒息死亡及术后气管狭窄等系列并发症，而直视下经声门气管插管由于创伤较小、安全性高、便于术后恢复等优点，是构建人工气道最常用的方法[7-8]。判定插管是否正确应在插管完成后随即进行,一旦判断插管不成功，即应迅速拔管重新插管,避免麻醉大鼠发生严重呼吸抑制。

目前关于小动物气管插管方面研究，多需要特殊设备辅助[5]，该实验干预方法不需特殊设备,简便易行,自制气管插管材料简单，成本较低，并可根据研究动物体重不同，改变腰穿针及静脉留置针型号，构建适合的气管插管。不足之处在于，照明不足、暴露不良的情况下，若不能准确观察到开合的声门就容易将插管送入食管，因此该技术对操作者熟练度有一定要求。关于高氧组新生鼠存活率低于对照组，考虑和高氧导致肺损伤有一定相关性[9]。气道内干预物体积过大，容易引起肺损伤，严重者导致窒息。目前关于小动物气道内干预物体积的研究较少，且干预用量不一[6, 10]。本实验探索15-35g体重小动物，证实气道内给予2 μL/g干预体积具有可行性，无明显肺损伤。该实验表明，此种气道内干预方法可推广应用到支气管肺发育不良干预研究中。

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Application of airway intervention in rat model of bronchopulmonary dysplasia

LIUYu-fang,FENGZhi-ChunDepartmentofNeonatalIntensiveCareUnit,BayiChildren'sHospital

AffiliatedtoClinicalMedicalCollegeinArmyGeneralHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230000,China

Objective To explore a simple and feasible way of airway intervention, and to apply to the model of pulmonary dysplasia in animals. Methods 24 one-day old neonatal SD rats were divided into 2 groups, the air control group and the group of 75% oxygen environment in the establishment of a high oxygen induced neonatal rat BPD model. After 14 days, the neonatal rats were taken out of the oxygen environment. The two groups were made by self-made endotracheal intubation, through the way of the trachea intubation, 2ul/g physiological saline was given in the airway. The body weight, the intubation time, the survival rate of newborn rats after intervention, and neonatal rat vigor in the two groups were observed. After the birth of 21day, these rats were killed, and their lung tissue was taken for HE staining, and the morphological changes were observed. Results After BPD model was established, the body weight of newborn rats in the high oxygen group was lower than that of the air control group, the intubation time was longer than that of the control group (P<0.05). The larger the body weighted, the shorter he time required (r=-0.719,P<0.05). The survival rate of neonatal rats in the high oxygen group was lower than that of the control group (83.3% vs 100%), but all above 80%. Compared with the control group, the activity of neonatal rats in the high oxygen group was less, HE staining suggested lung tissue damaged, and alveolar declined. But in the control group, there was no abnormal lung tissue structure. Conclusion The airway intervention method which 2ul/g physiological saline is given in rats airway through endotracheal intubation, is simple, with the advantages of low cost and high survival rate of newborn rats, which can be applied to the animal experimental study of the need for airway administration.

high oxygen; neonatal rats; tracheal intubation; bronchopulmonary dysplasia

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.023

230000 安徽 合肥，安徽医科大学陆军总医院临床学院

封志纯，E-mail:zhjfengzc@126.com

2016-09-13]