胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅血液生化指标和胸肌发育的影响

滕战伟，刘 逍，李德生，徐 晗，周海柱，娄玉杰

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅血液生化指标和胸肌发育的影响

滕战伟，刘 逍，李德生，徐 晗，周海柱，娄玉杰*

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

本试验采用胚蛋注射技术研究孵化后期补充外源性营养物质蛋氨酸对血液生化指标和胸肌发育的影响。选取300枚种蛋随机分为2组，每组3个重复，每个重复50枚种蛋。在孵化第24天进行蛋氨酸注射，对照组不做任何处理，处理组注射1.5 mL 蛋氨酸营养液（Met 5 mg/mL、NaCl 7.5 mg/mL）。出雏后，每个重复选取体重均匀和健康的雏鹅20只进行饲养试验，饲养28 d。结果表明：胚蛋给养蛋氨酸显著提高了朗德鹅的初生重和7 d体重（P＜0.05），处理组显著提高了0、7 d胸肌重（P＜0.05），有提高0 d胸肌指数的趋势（0.05≤P＜0.10），并且显著提高了0、7 d的肌纤维直径（P＜0.05）；处理组有提高雏鹅血清中总蛋白含量的趋势（0.05≤P＜0.10），显著提高了白蛋白含量并降低了血清尿酸含量（P＜0.05）；处理组显著提高了Myf5的相对表达量并降低了MSTN的相对表达量（P＜0.05）。试验结果显示，胚蛋给养蛋氨酸可通过调节Myf5和MSTN的mRNA相对表达量来促进胸肌的发育，促进了机体的生长。

胚蛋给养；鹅；蛋氨酸；胸肌发育

骨骼肌是机体蛋白质沉积的重要部位，而蛋氨酸能够参与机体蛋白质的合成，故日粮中的蛋氨酸水平对骨骼肌的发育有很大的影响。研究表明，日粮中的蛋氨酸缺乏时会抑制骨骼肌蛋白质的合成[1]；而适当提升日粮中的蛋氨酸水平可以促进骨骼肌的生长发育[2]。蛋氨酸除能够合成蛋白质外还能够参与调节机体的蛋白质代谢。前人研究指出，随着日粮中蛋氨酸水平的提高，血清中的尿酸含量是降低的，而血清中的总蛋白和白蛋白的含量是升高的[3-4]。胚蛋给养技术是在孵化后期将外源性的营养物质注射到家禽的胚蛋中。研究表明，胚蛋给养可以提高鸭的能量储备，促进其胸肌的发育[5]。本试验利用胚蛋注射技术来探索蛋氨酸对朗德鹅血液生化指标和胸肌发育的影响，为蛋氨酸在鹅生产中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用种蛋购自吉林省梅河口市德坤禽类食品有限公司，种蛋保存时间均在7 d以内。DL-蛋氨酸购自诺伟司饲料添加剂（上海）有限公司，其纯度≥99%。

1.2 试验设计与分组 试验采用单因素完全随机区组设计。选择母鹅产蛋史、产次和营养摄入相近的朗德鹅种蛋300枚，依据种蛋的储存时间（7 d内）、种蛋重及蛋形指数将其分为3个重复，每个重复50枚种蛋。在种蛋孵化期的第24天进行胚蛋给养，对照组不进行任何处理，处理组每枚种蛋注射1.5 mL 的蛋氨酸营养液（Met 5 mg/mL、NaCl 7.5 mg/mL）。孵化至出雏后，每个重复挑选20只健康且体重无统计学差异的雏鹅进行饲养，试验周期为28 d。

1.3 种蛋的孵化 选择德州科裕孵化设备有限公司制造的科裕CFZ微电脑全自动孵化机进行孵化。根据鹅的胚胎发育规律孵化分为前期（1～14 d）、中期（15～28 d）、后期（29～30 d）3个阶段。孵化期采用全进全出制变温孵化。3个阶段的湿度和温度各不相同，分别控制在70%和37.8℃、65%和37.5℃以及72%和36.5℃。由于鹅蛋蛋壳相对较厚，蛋壳的表面积相对小，孵化后期产热增加，影响胚蛋内羊水和卵黄囊营养吸收，导致胚胎提前出壳或者死胚。所以，从孵化的第18天开始至第24天，每天中午凉蛋1次，第25～28天，每天凉蛋3次。在孵化的29 d将胚蛋转入出雏机内继续孵化直至出壳。其他孵化管理按常规孵化程序进行。

1.4 胚蛋给养 胚蛋给养参照Tako等[6]介绍的方法，但进行了修改，具体步骤如下：首先通过照蛋，确定注射部位羊膜腔的位置，然后用75%的酒精棉球对钝端注射部位进行消毒，在消毒过的区域钻适宜大小的孔，用5 mL注射器垂直进针（深度为2 cm左右），将营养液注射到羊膜腔中（1.5 mL/枚），为避免感染，每枚胚蛋用1枚针头。注射完毕后经再次消毒后，用灭菌的石蜡迅速封口，然后按照正常的孵化程序继续孵化直至出壳。

表1 基础日粮组成及营养成分（风干基础）

1.5 饲养管理 参照NRC（1994）推荐的鹅营养需要来配制饲粮[7]（表1），出壳后雏鹅分为3个重复进行饲养，在出壳后12 h内开水、24 h内开食，并严格控制饲养环境条件。雏鹅的饲养管理和免疫按照常规程序进行。

1.6 样品采集 在出壳当天（出壳2 h以内，0 d）、第7天（7 d）、28天（28 d）从每组选取6羽（每个重复2羽）鹅胚/雏鹅进行组织样品采集。在雏鹅第7、28天颈静脉取血液样品5 mL于离心管中，3 000×g离心15 min，将上清液分装于0.5 mL的EP管中，置于-80℃低温冰箱中保存待测。试验雏鹅采血完毕，颈部放血致死，将胸肌样品完整取出，用预冷的生理盐水小心冲洗并去除其上附属的其他组织，然后将左侧胸肌分成3份，迅速放入准备好的液氮中冷冻，置于-80℃超低温冰箱中保存用于后续胸肌发育相关基因表达的测定；将右侧胸肌称重后置于4%的福尔马林溶液中，用于肌纤维形态学分析。

1.7 测定指标与方法

1.7.1 体重及胸肌指数的测定 于出壳当天、7 d、28 d取样前称取雏鹅的重量并将分离的胸肌进行称重，根据记录的体重和胸肌重计算胸肌指数。

1.7.2 血液生化指标分析 采用日立7170A型全自动生化分析仪对血清中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、总蛋白、白蛋白、尿酸、谷丙转氨酶以及谷草转氨酶进行分析，试验所用试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。

1.7.3 胸肌纤维直径的测定 取出福尔马林溶液中的胸肌样品，制作成石蜡切片，并进行HE染色，用光学显微镜和Toup View视频成像装置于10×40倍镜下进行切片观察，并对图像进行采集。每图随机选取视野，测量20根肌纤维直径。

1.7.4 胸肌发育相关基因表达量的测定 本试验中以鹅β-actin作为内参，β-actin、Myf5和MSTN基因的引物设计参考NCBI基因库进行设计，利用Primer 5.0设计引物，最终引物序列见表2。

提取肌肉组织的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，用核酸定量仪测定总RNA浓度以及吸光度D260/D280的值，此值在1.8～2.0范围内说明RNA纯度较高，适宜进行下一步的实验。应用荧光定量PCR技术测定各基因的表达量，反应体系：dH2O 12.5 μL，上、下游引物以及样品各1 μL，SYBRR Premix Ex TaqⅡ 9.5 μL，总反应体系为25 μL。反应条件：预变性95℃ 30 s,变性95℃ 5 s,

表2 测定基因引物序列

退火60℃ 30 s,延伸95℃ 15 s,60℃ 1 min，95℃ 15 s，35个循环。

以β-actin为内参基因，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量，其中各目的基因在胸肌样品中的△△Ct值均以该基因在0 d胸肌的△Ct作为对照。

1.8 统计分析 试验数据经Excel 2010进行整理归纳后，用SPSS18.0统计软件进行统计分析，采用t检验进行差异显著性检验，以P＜0.05为显著性判断标准，以0.05≤P＜0.10为有趋势判断标准。所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅体重和血液生化指标的影响 由表3可知，胚蛋给养蛋氨酸显著提高了朗德鹅的初生重和7日龄的体重（P＜0.05）。由表4可知，处理组有提高7 d血清中总蛋白含量的趋势（0.05≤P＜0.10），显著提高了7 d血清中白蛋白含量（P＜0.05），并有提高28 d血清中白蛋白含量的趋势（0.05≤P＜0.10）。处理组显著降低了7 d和28 d血清中尿酸含量（P＜0.05）。处理组对不同时间点血清中的血糖、甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酸和谷草转氨酶无显著性影响（P＞0.10）。

2.2 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅胸肌发育的影响 由表5可知，胚蛋给养蛋氨酸显著提高了0、7 d的胸肌重（P＜0.05），并有提高0 d胸肌指数的趋势（0.05≤P＜0.10）。由表6可知，处理组显著提高了0、7 d朗德鹅胸肌肌纤维直径（P＜0.05），并有提高28 d胸肌纤维直径的趋势（0.05≤P＜0.1）。由图1和图2可知，处理组提高了Myf5基因的相对表达量并降低了MSTN基因的相对表达量（P＜0.05）。

3 讨 论

表3 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅体重的影响 g

表4 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅血液生化指标的影响

表5 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅胸肌重及其指数的影响

表6 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅胸肌纤维直径的影响 μm

图1 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅MSTN表达量的影响

3.1 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅体重的影响 家禽与哺乳动物不同，其胚胎处于一个相对封闭的环境内，孵化期胚胎生长发育所需的营养物质均来自于种蛋。在孵化后期，胚胎的生长发育较快，由于可吸收利用的营养物质有限，其生长发育不能够达到最大化。Isa Coskun等[8]研究表明，胚蛋给养蛋氨酸显著提高了鸡的出壳重。李世召等[9]研究表明，胚蛋给养3 mg维生素C显著提高了肉仔鸡的初生重，并显著降低了1～42 d的饲料增重比，促进了生长。本试验研究表明，胚蛋给养蛋氨酸提高了朗德鹅的初生重，同上述研究结果一致。

图2 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅Myf5表达量的影响

3.2 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅血清生化指标的影响血液生化指标反映了机体的一般营养利用状态。家禽上常用血清中尿酸的含量来表示机体对氨基酸的利用状态。本试验研究表明，胚蛋给养蛋氨酸降低了血清中的尿酸含量，同时提高了血清中的总蛋白和白蛋白的含量，这表明胚蛋给养蛋氨酸促进了机体对蛋白的利用。这与李德生[10]在吉林白鹅上的研究相一致。血清中转氨酶活性的高低可用来判断肝脏是否受到损伤。谢明[11]研究指出，在北京鸭日粮中添加过量的蛋氨酸或者其羟基类似物可以对肝脏造成损伤。本试验研究表明，胚蛋给养蛋氨酸对血清中的谷丙及谷草转氨酶的含量无显著影响。由此可以看出，胚蛋给养蛋氨酸没有造成朗德鹅肝脏的损伤。

3.3 胚蛋给养蛋氨酸对朗德鹅胸肌发育的影响 在胚胎后期由于机体快速生长，为使胚胎能够更好地适应外界环境和内部生理代谢的变化，家禽的骨骼肌往往会发生大量降解，动员蛋白质产生氨基酸作为糖异生的底物和肠道发育所需的氨基酸，造成肌纤维萎缩，影响后期的生长发育。陈伟[5]研究表明，在鸭的胚蛋后期胸肌发生了动员，为机体的发育提供能量；但是通过胚蛋给养的方法向鸭胚补充二糖可以缓解机体能量缺乏的状态。本试验研究表明，胚蛋给养蛋氨酸提高了朗德鹅0、7 d的胸肌重，并有提高0 d胸肌指数的趋势。李德生[10]研究表明，胚蛋给养二糖和蛋氨酸可以提高吉林白鹅的胸肌纤维直径，本试验研究结果与其一致。研究表明，在日粮中添加蛋氨酸可以提高低出生重肉仔鸡Myf5 mRNA的相对表达量，并降低MSTN基因的甲基化水平及其相对表达量，促进其胸肌的发育[12]。本试验研究表明，通过注射蛋氨酸提高了朗德鹅胸肌Myf5 mRNA的相对表达量，同时降低了MSTN mRNA的相对表达量。综上，胚蛋给养蛋氨酸提高了朗德鹅的胸肌重，提高了胸肌纤维直径，通过调节Myf5和MSTN mRNA的相对表达量促进了胸肌的发育。

4 结 论

本试验研究表明，胚蛋给养蛋氨酸提高了朗德鹅0、7 d的体重，提高了血清中总蛋白和白蛋白的含量，降低了血清中的尿酸含量；提高了朗德鹅的胸肌重及其指数，提高了胸肌肌纤维直径，提高了Myf5基因的相对表达量并降低了MSTN基因的相对表达量。

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更正

2017年第1期刊出文章题为：“BMPR1B基因在细毛羊皮肤毛囊中的表达及与羊毛性状的关系的研究”，作者排名为：王小佳1，贺建宁1，程 明2，刘开东2，刘积凤1，柳 楠1*，需更正为王小佳1，刘开东2，贺建宁1，程 明2，刘积凤1，柳 楠1*。

S835.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-093

2016-08-10；

2016-09-01

国家自然科学基金（31372331）

滕战伟（1988-），男，河南鄢陵人，硕士研究生，动物营养与饲料科学专业，E-mail: tengwei416@126.com

* 通讯作者：娄玉杰，教授，博士生导师，E-mail: lyjjlau@163. com