液相色谱-原子荧光联用技术与元素形态分析

寿淼钧 李伟 赵富荣 裴晓华

(1.聚光科技(杭州)股份有限公司,杭州 310052；2.北京吉天仪器有限公司,北京 100015)

综 述

液相色谱-原子荧光联用技术与元素形态分析

寿淼钧1,2李伟2赵富荣2裴晓华2

(1.聚光科技(杭州)股份有限公司,杭州 310052；2.北京吉天仪器有限公司,北京 100015)

原子荧光光度计(AFS)作为一种高灵敏度的分析技术在砷、汞、硒等元素的分析方面具有独特优势，在与色谱分离技术相结合后，具有可以与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)相媲美的灵敏度。本文介绍了液相色谱与原子荧光(HPLC-AFS)联用技术在元素形态分析方面的应用，目前的研究主要集中在砷、汞、硒、锡等元素的形态分析，研究对象以食品、海产品、农产品、水、土壤/沉积物、中药/中成药居多。

液相色谱-原子荧光(HPLC-AFS)联用 重金属、形态

元素的生物行为和毒理性质都与其在样品中存在的化学形态紧密相关。汞和砷是有毒元素，但不同型态的汞和砷其毒性差别很大。以砷为例：常见的砷化合物包括亚砷酸(As(III))、砷酸(As(V))、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(MMA)、砷甜菜碱、砷胆碱、砷糖等。其中无机砷毒性大于有机砷毒性，As(III)>As(V)>MMA>DMA，砷与有机基团结合越多，毒性越小，砷胆碱和砷甜菜碱普遍被认为是无毒的。仅测量体系中元素的总量已不能满足科学家们在生物、环保、临床医学、毒理学等各个研究领域的需要，只有知道元素在样品内的实际状态以及化学活性、生物活性和毒性等重要信息，才能清楚地描述待测物的性质。而且因为元素的多种形态在不同条件下存在各种转化情况，所以元素的形态分析比元素总量分析要复杂得多。

1 化学形态分析的主要方法

联用技术是元素形态分析的主要分析手段，将样品中的多种形态价态的混合物分离与测定结合在一起，综合了色谱的高分离效率与检测器的专一性、高灵敏度。分离技术主要以高效液相色谱(HPLC)、离子色谱(IC)、气相色谱(GC)或毛细管电泳(CE)为主，检测部分主要是原子荧光光谱(AFS)、质谱(MS)类仪器。

1.1 HPLC-ICP-MS

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)具有极高的灵敏度、干扰少、可以多元素同时检测、动态范围宽等特点。在元素形态分析中检出限比ICP-AES低2～3个数量级[1]。

《中华人民共和国药典 2015版》第四部[2]中采用了高效液相色谱法-电感耦合等离子体质谱测定法进行砷形态及其价态进行了测定。采用聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物载体键合三甲基铵阴离子交换材料或相当材料为填充剂，以磷酸二氢铵和水为流动相，梯度洗脱了亚砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷胆碱、砷甜菜碱这几种不同形态或价态的砷。文献中关于HPLC-ICP-MS在形态方面的应用也以检测中药/中成药[3-5]、食品[6，7]、环境[8，9]中的砷、汞、硒元素为主。

但是，ICP-MS仪器较昂贵，维护费用高，对操作人员技术要求较高，且存在同量异位素、多原子分子离子以及多电荷离子的干扰问题。ICP-MS对在色谱分离中常常使用的高盐组分和高含量有机组分承受能力有限，一定程度上限制了ICP-MS与HPLC的联用。

1.2 HPLC-AFS

AFS具有分析灵敏度高、线性范围宽等特点。采用蒸气发生-原子荧光(VG-AFS)联用在某些元素上具有和ICP-MS相当的检出限和灵敏度。对于ICP-MS不耐受高盐组分和高含量有机组分的问题，由于蒸气发生技术实现了待测组分与基体的有效分离，VG-AFS可以更大程度的避免盐、有机组分的干扰。另一方面AFS成本低易维护、干扰少，更易于推广[10]。目前有《中华人民共和国国家标准GB 5009.11-2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》和《GB 5009.17-2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》两个国家标准采用了HPLC-AFS进行无机砷和有机汞的检测。

2 HPLC-AFS的主要应用

AFS受工作原理限制，目前主要可检测的元素主要有砷(As)、汞(Hg)、锑(Sb)、铋(Bi)、硒(Se)、碲(Te)、铅(Pb)、锡(Sn)、锗(Ge)、锌(Zn)、镉(Cd)等。而采用HPLC-AFS进行检测的对象初期主要集中在砷、汞上，近年来也开始有越来越多的科研工作者开始进行硒、锡的形态分析研究。

2.1 砷

目前HPLC-AFS多用于食品、环境、中药中的无机砷检测。

(1)食品：《中华人民共和国国家标准GB 5009.11-2014 食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中无机砷的测定第一法即液相色谱-原子荧光光谱法(LC-AFS)。采用阴离子交换色谱柱，按分析基质的不同种类进行等度(分离了亚砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷)[11]或梯度(分离了亚砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱)洗脱。待测物为稻米类样品时，可采取等度法进行分离；当待测物为海产品、或含有海产品的婴幼儿辅食时，则必须采用梯度法进行分离，因这类样品中可能含有砷甜菜碱，如果采用等度法进行分离容易造成As(III)的假阳性判断。

(2)环境：龚仓等人[12]、顾海东等人[13]分别测定了大气颗粒物中、土壤中的砷形态；龚仓等人采用大流量采样器进行样品采集、用1mol/L的H3PO4超声提取，考察了流动相的种类、梯度洗脱时间与比例，最终确定了10mmol/L和200mmol/L的NH4H2PO4为流动相，在1～3min内，流动相配比为60%/40%为最佳分离条件。顾海东等人分别考察了柠檬酸铵-盐酸、草酸铵、磷酸、磷酸盐、碳酸钠、碳酸氢钠等提取剂对于土壤中砷形态的提取效果，结果表明磷酸提取效果最佳。采用正交实验法考察了提取剂浓度、提取时间、提取次数、提取温度这4种因素对结果的影响。

(3)中药：姜泓等人[14]测定了雄黄在水、人工胃液、人工肠液中可溶性中As(III)的含量。结果发现雄黄在人工胃液及人工肠液中As(III)的溶出量均高于在水中的溶出量，从而增加了雄黄对机体的毒性。祖文川[15]等人测定了6种植物源性中药中砷的形态。文中分别考察了酸热浸提、超声辅助提取、微波辅助提取这3种常用形态前处理手段，结果表明酸热浸提法对于不同形态砷提取效果最佳，甲醇水溶液(1+1)超声辅助提取和水微波辅助提取未能有效提取有机砷。在微波辅助提取中，加入适量酸对有机砷的提取效率有一定改善。

2007年，北京吉天仪器有限公司就曾采用HPLC-AFS联用的方式检测了原有无机砷检测方法的中间产物[16]，证明了原有无机砷检测方法的不能有效地区分有机和无机砷形态，所以对于有机砷中砷糖含量较高的海藻会造成误报。另外还比较了盐酸法和水甲醇法两种提取效率，盐酸提取法提取效率略高，且谱图简单，更适合无机砷的检测。2009年曾发表文章对于化妆品中砷、锑同测的条件进行摸索[17]，优化了流动相配比、色谱分离和仪器检测条件，为化妆品中砷、锑同测提供了新的方法。

2.2 汞

自然界中的汞以单质汞、无机汞和有机汞的形态存在，由于汞不同形态的毒性有较大差异，同时，在环境中的迁移以及在动植物体内的转化和毒性与它们的形态直接相关，食品、环境和生态研究中汞的形态分析越来越引起人们的关注。有机汞的毒性大于无机汞，其中又以甲基汞的毒性最强，它也是一种主要的水体污染物，且对神经系统有强烈的毒性作用。甲基汞中毒主要为神经系统症状，例头痛、疲乏、健忘等。为免消费者受到甲基汞残留危害，我国国家标准《GB 5009.17-2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》和农业行业标准《NY 5073-2006 无公害食品：水产品中有毒有害物质限量》中都进行了甲基汞的含量要求。

目前，研究较多的是食品和环境应用领域，食品中尤其是海产品/水产品中甲基汞的含量测定[14-16]研究更多。赵凯等人[18]和刘庆阳等人[19]采用KOH甲醇溶液作为提取液，采用(乙酸铵+二巯基乙醇)和甲醇(或乙腈)作为流动相分析海产品中的甲基汞；国家标准《GB 5009.17-2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》和蒋天成等人[20]采用了酸性提取液提取样品，采用(乙酸铵+L-半胱氨酸)溶液和甲醇(或乙腈)作为流动相进行汞形态分离。因无机汞、甲基汞及其他有机汞与特定的络合剂形成复合物后，极性差异增大，可由液相色谱进行分离。常用的络合剂主要有二硫代氨基甲酸盐、巯基化合物、双硫腙等。

戴彦韵等人[21]采用HPLC-AFS进行了婴幼儿辅食中汞的形态研究，因为婴幼儿辅食中广泛添加深海旗鱼和金枪鱼等鱼类，而之前媒体曾多次报道过婴幼儿罐装辅助食品中有总汞含量超标的情况，从测试结果中也发现在4种总汞阳性的样品中，甲基汞的含量占到90.8～95.8%。毛永杨等人[22]进行了食用菌中的汞形态研究，因为食用菌对土壤及生长环境中汞具有较强的生物富集作用，因此分析食用菌中汞的不同形态对于避免人体慢性汞中毒具有现实意义。

当进行水或沉积物中汞形态时，样品前处理方法尤为重要。赵云芝等人[23]对比了巯基棉富集与液-液萃取法，两种方法的回收率都满足实验分析要求，最终选择了萃取效率高且简单快速的液-液萃取。冷庚等人[24]则选用了2-巯基乙醇络合剂用于沉积物样品中汞形态的微波辅助萃取，并对萃取条件与萃取物的稳定性进行了考察，实验结果显示该方法可以有效萃取沉积物中的汞，且方法简单、快速。

吉天公司曾通过和多家应用单位合作，共同参与、推进了《SN/T 3034-2011 出口水产品中无机汞、甲基汞和乙基汞的测定 液相色谱-原子荧光光谱联用(LC-AFS)法》、《SN/T 3134-2012 出口动物源性食品中硫柳汞残留量的测定 液相色谱-原子荧光光谱法》的发布与实施。针对水、土壤、植物等基质中的汞形态，也进行了大量的研究。与四川宜宾市环境监测站合作采用HPLC-AFS法结合固相萃取技术优化了水样中痕量甲基汞的富集条件[25]，使得甲基汞在0.2～20.0μg/L的浓度范围内线性关系良好。与北京大学环境工程学院合作采用灯内紫外处理器将所有汞的形态在线消解为无机汞[26]，无需辅助氧化剂，抗有机溶液和基体的干扰能力强，采用整体柱进行流速梯度洗脱将分析时间缩短，采用控温混旋提取装置用于实际样品提取，实验样品快速前处理。与清华大学合作进行了植物中的汞形态研究[27]，通过盐酸混合提取液提取，C18分析柱分离，对于来自冶炼厂附近植物的不同部位汞形态含量进行测定。

2.3 硒

硒是生物体内必须的微量元素，具有重要的生理生物活性。无机形态的硒化物主要是Se(II)，H2Se有毒且不稳定；单质Se(0)以不溶态存在；Se(IV)、Se(VI)多以盐的形式存在，稳定、耐碱、耐氧化。有机形态的硒化物包括：硒代蛋氨酸来自于植物体；硒代半胱氨酸来自于动物体。哺乳动物体内大部分的硒以硒代半胱氨酸的形式在相应功能蛋白中发挥生物活性作用。

对于硒的HPLC-AFS分析方法，肖志明[28]等人采用磷酸氢二铵缓冲液作为流动相，Hamilton阴离子交换柱PRP X-100(250mm×4.1mm，10μm)，7%盐酸作为载液，2%硼氢化钾(含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾)作为还原剂，基线分离了SeMet、SeMeCys、Se(IV)、Se(VI)四种硒形态并测试了活性酵母饲料添加剂中的硒含量。姚晶晶[29]等人采用15mM磷酸氢二铵(pH=4.5)作为流动相，阴离子交换色谱柱Dionex IonPac AS10(250mm×4mm i.d.，5μm)，10%盐酸作为载液，2%硼氢化钾(含0.5%氢氧化钾和0.1%碘化钾)作为还原剂，开UV灯，基线分离了SeCys、SeMet、Se(IV)三种硒形态并测试了茶叶中的硒含量。

吉天公司针对富硒营养品同时进行了砷和硒的形态测定[30]，考察了流动相中磷酸氢二铵的浓度、氢化物发生的条件、AFS测量条件对于分离的影响，并测试了富硒营养品中的砷和硒含量；与中国水产科学研究院黄海水产研究所合作考察了水产品中硒的形态[31]。水产品中的硒经浸提后，由于阴离子交换色谱柱对硒的各种形态吸附能力不同，流动相将其依次洗脱，优化了前处理条件和仪器条件，建立了水产品中硒形态含量的测定方法。

2.4 锡

金属锡在自然环境中具有多种形态，无机锡被认为基本无毒，有机锡则表现出了复杂的毒性模式，欧盟各国通过了系列法令限制有机锡的使用。有机锡即含有金属元素又具有有机物的性质，因此可以采用气相色谱、液相色谱与原子吸收、质谱等联用的方式。因采用GC进行分离时前处理过于复杂，而采用HPLC则相对简单，不需要衍生。

李勇[32]等人检测了海产品中的三甲基锡、一丁基锡、二丁基锡、三丁基锡。采用紫外光照射使得C-Sn键断裂，分解后的锡为四价锡，如果直接进入氢化物发生，产生的SnH4不稳定，在室温下易分解。使用硫脲和抗坏血酸将四价锡还原为二价锡，再进行氢化物发生就能生成较为稳定的SnH2。

邓爱华[33]等人研究发现二甲基锡、三甲基锡和二苯基锡均能在酸性条件下与硼氢化钾形成可挥发性有机锡氢化物，经载气带入原子荧光光度计后被激发产生荧光。采用Agela-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，甲醇-水-醋酸-三乙胺(60∶40∶1∶0.03)作为流动相，5%盐酸作为载液，2%硼氢化钾作为还原剂，5分钟内基线分离了二甲基锡、三甲基锡和二苯基锡。另外，研究显示流动相的组成对于化合物的分离有非常大的影响。

3 总结与展望

将HPLC和AFS联用可以利用色谱技术将不同形态的金属化合物进行分离，再利用原子荧光检测技术对各形态的金属化合物进行检测，充分利用原子荧光的高灵敏度、专一性和抗干扰能力的优势，开发更多应用领域与待测元素，HPLC-AFS法是一项非常有前途的分析方法。

HPLC-AFS联用法中的样品前处理步骤不仅需要尽可能完全的提取出待测物，还需要最大程度的保存各元素的形态，在提取过程中减少或避免元素间不同价态的转化，这就使得样品前处理过程尤为重要。当样品基质过于复杂，或样品基质中包含某些具有氧化性或还原性的物质时，提取方式、提取溶剂、提取温度都将影响最终测试结果。应用、发展有效的前处理技术是保证元素形态分析成功的关键步骤。

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更 正

因本刊编辑工作上的疏漏，2017年第三期《焦炉煤气原位整体式干法样气处理系统研究与实践》一文的基金项目重庆市教委科学技术项目(KJ1713322)；重庆科技学院研究生科技创新项目(YKJCX1620409)漏登，特此更正，并向张恒健等作者致歉。

《分析仪器》编辑部

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.04.001

2017-04-05

寿淼钧，男，1978年出生，高级工程师，主要从事实验室仪器行业产品开发和管理工作。