鸭坦布苏病毒的分离和PCR鉴定

曹宗喜+贺冬梅++叶保国+张艳++杨少雄++陈朝喜+林哲敏

摘要：鸭坦布苏病是危害养鸭业最严重的传染病之一。从某鸭场的疑似鸭坦布苏病病死鸭中分离到1株病毒，并对该毒株进行PCR鉴定和序列分析。结果显示，分离株的序列与GenBank上登录的DTMUV序列的同源性在99%以上，表明分离的病毒为鸭坦布苏病毒。

关键词：鸭坦布苏病毒；分离；PCR鉴定

中图分类号： S858.325.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0152-01

鸭坦布苏病毒病（duck tembusu virus disease）是由鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus，DTMUV）感染所致的蛋鸭、种鸭以产蛋率和采食量突然下降为主要特征的传染病[1-2]。该病自2010年在福建省、浙江省、江苏省、安徽省、山东省、河北省等地区的鸭群中相继暴发，约导致1.2亿羽蛋鸭和1 500万羽肉鸭发病，经济损失达数十亿元，对我国鸭养殖业造成了巨大损失[3-5]。鸡、鸭以及养殖场周围的麻雀、蚊子均有被感染的报道[6-8]，这为该病的防控提出了新挑战。本研究以鸭坦布苏病疑似样品为研究对象进行病原分离鉴定，为鸭坦布苏病毒的进化关系及其致病性的进一步研究提供了参考。

1材料

RNAiso Plus、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、DL 2 000 DNA marker均购自TaKaRa公司。

2方法

2.1病料采集与处理

从国内主要鸭养殖区收集鸭坦布苏病疑似样品。无菌采集病鸭的肝脏、脾脏等病变组织，取病料约1.0 g并置于灭菌研磨器中，加入5倍体积含抗生素的PBS缓冲液研磨制成混悬液，反复冻融3次，以8 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜除菌，置于-20 ℃下保存备用。

2.2病毒分离

[JP2]将处理好的病料接种于9～11 d的鸭胚，每个胚接种 0.2 mL，每天观察鸭胚。如果无死亡鸭胚则7 d收获，盲传5代仍无病变且用PCR方法检测为阴性者，作为病毒分离阴性。[JP]

2.3引物设计与合成

参照胡旭东等的引物[9]进行设计，F：5′-GCCACGGAATTAGCGGTTGT-3′；R：5′-TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG-3′。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，采用灭菌超纯水稀释至10 μmol/L，于-20 ℃下保存备用。

2.4PCR鉴定

RNA抽提和反转录按照试剂盒说明书进行操作。扩增体系及程序分别以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系（20 μL）为：10×Ex Taq buffer 2 μL、上游及下游引物各1 μL、dNTP Mixture 2 μL、Ex Taq酶0.1 μL、cDNA 2 μL，加水补足至20 μL。扩增反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。取PCR产物5 μL，采用1%琼脂糖凝胶电泳观察并分析PCR产物。按凝胶回收试剂盒说明书纯化回收PCR产物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，采用Lasergene 7.10软件对所测序列进行Blast比对分析。

3结果与分析

3.1病毒分离

病毒分离时，试验组鸭胚于3～7 d内部分死亡，可见胚体出血水肿、发育不良。

3.2PCR扩增

取PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，分离株出现400 bp的条带，与预期目的条带相符。

3.3基因序列测定与分析

采用Lasergene 7.10软件对测序结果进行同源性分析，所[CM（25]扩增序列与GenBank上登录的DTMUV序列的同源性在

99%以上，表明分离的病毒为鸭坦布苏病毒。

4讨论

鸭坦布苏病是危害养鸭业最严重的传染病之一[3，5]。对某鸭场发病鸭根据流行病学、临床特征、剖检特点初步诊断为鸭坦布苏病，经过病毒分离，获得病毒分离株。通过PCR扩增出与预期大小相符的400 bp目的片段，对扩增片段进行测序及Blast分析，确定分离病原为鸭坦布苏病毒。本试验为鸭坦布苏病毒进化关系及其致病性的进一步研究奠定了基础。

参考文献：

[1]Su J，Li S，Hu X，et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus，a new Tembusu-related flavivirus[J]. PLoS One，2011，6（3）：e18106.

[2]Yan P X，Zhao Y S，Zhang X，et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J]. Virology，2011，417（1）：1-8.

[3]Cao Z Z，Zhang C，Liu Y E，et al. Tembusu virus in ducks，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2011，17（10）：1873-1875.

[4]Li L L，An H J，Sun M H，et al. Identification and genomic analysis of two duck-origin Tembusu virus strains in Southern China[J]. Virus Genes，2012，45（1）：105-112.

[5]Zhu W J，Chen J D，Wei C Y，et al. Complete genome sequence of duck tembusu virus，isolated from muscovy ducks in Southern China[J]. Journal of Virology，2012，86（23）：13119.

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[7]Tang Y，Diao Y，Chen H，et al. Isolation and genetic characterization of a tembusu virus strain isolated from mosquitoes in Shandong，China[JP2][J]. Transboundary and Emerging Diseases，2015，62（2）：209-216.[JP]

[8]Tang Y，Diao Y，Yu C，et al. Characterization of a tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows （passer domesticus） in Northern China[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2013，60（2）：152-158.

[9]胡旭東，路浩，刘培培，等. 我国发现的一种引起鸭产蛋下降综合征的新型黄病毒[J]. 中国兽医杂志，2011，47（7）：43-47.