浅析SSR分子标记实验操作

2017-04-14张肖逢

山西农经 2017年10期

关键词：玻璃板混合液硫酸铵

□张肖逢刘姗

（河北农业大学农学院河北保定 071000）

浅析SSR分子标记实验操作

□张肖逢刘姗

（河北农业大学农学院河北保定 071000）

SSR是新兴起的一种较为理想的遗传标记技术，在科学研究中已经得到广泛的应用。本文简单介绍了SSR分子标记的实验过程，以期为SSR分子标记技术的普及而服务。

SSR；PCR扩增；步骤

1SSR实验步骤

常用的DNA提取主要有：CTAB法和SDS法。提取过程中要减少物理、化学等因素对核酸结构的破坏，也要防止核酸自身的生物降解。

1.2 引物的筛选

为了提高PCR扩增的效率，引物分为正、反两类。现在可直接从公司购买。

1.3 PCR扩增

扩增反应体系为15μl，包含3μl模板DNA、7.5μlMIX、正反引物各0.5μl和超纯水3.5μl（在冰板上进行）。反应程序：①95℃预变性5min②94℃变性30s③55℃退火30s④72℃延伸30s，②③④这三个步骤循环35次，⑤72℃延伸10min，可在4℃过夜。

1.4 电泳（以变性聚丙烯胺凝胶电泳为例）

1.4.1 实验中所用试剂及其配制。变性胶的配制：40%丙烯酰胺150ml、5×TBE200ml、尿素420.24g三种试剂混合，加蒸馏水至1 000ml，用玻璃棒搅拌至溶液变澄清即可。变性胶不需要现配现用。丙烯酰胺有毒，配制过程中要戴手套。

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过硫酸铵的配制：超纯过硫酸铵2g在超纯水18ml中溶解并混合均匀，可放置在4℃中保存。

TEMED：购买后可直接使用。

银染溶液：取4g硝酸银充分溶于2 000ml蒸馏水，实验过程中可重复使用，染色9～12块板换一次。

显色溶液：取30g氢氧化钠充分溶于2 000ml蒸馏水中，放入胶板前加入8ml甲醛。甲醛具有挥发性且有毒，实验时带好口罩并打开通风扇。

1.4.2 实验步骤。

1.4.2.1 玻璃板准备及灌胶

1）玻璃板擦拭：将玻璃板放置于水平界面，将待用的两面玻璃板用2ml95%无水酒精擦拭一遍。取1.5ml95%无水酒精、10μl0.5%冰醋酸和10μl亲和硅烷于2mlEP管内，混合均匀（现配现用）倒在亲水玻璃板（平板）用纸巾涂抹均匀。同理，将500μl剥离硅烷在疏水玻璃板（凹板）上用同样的方法均匀涂抹。之后进行玻璃板的组装。

2）玻璃板的组装：在平板的两边边缘各放置一个配套的塑料条，再将凹板涂有剥离硅烷的一面盖在平板上，两边各用两个大夹子夹住两块玻璃板。

3）配制凝胶：100ml变性胶、过硫酸铵200μl和100μlTEMED（两块板）迅速轻轻摇晃混合均匀，混匀后立即灌胶。此过程中的过硫酸铵和TEMED分别是加速剂和催化剂，适当的增加可以加速混合液的凝结，建议初学者适当减少过硫酸铵和TEMED的用量。

4）灌胶：用50ml大注射器吸取配制好的胶的混合液，将注射器里面的空气排出，直接用注射器注入，注入时，控制推动力度均匀防止产生气泡，可拍打凹板上面加速混合液的流动。若有剩余的混合液不可倒入水池内，以免胶凝后堵塞下水道。

5）静置：待灌胶完成后，迅速在两个玻璃板之间插入梳子无齿端，在插入过程中要注意不要产生气泡。静置至少1h。

1.4.2.2 凝胶电泳

1）待胶凝好后，拔下梳子和去除大夹子，用水清洗玻璃板两面，以去除残余的凝胶。插上梳子的另一端。插好后，放在电泳槽内，正负极槽内加入适宜的1×TBE。

2）为清除凝胶内的杂质，预电泳10min，电压2000V、电流200mA、功率120W、TIME模式（两块板）。

3）预电泳结束后，关闭电源，用100μl的枪将胶内的气泡打出。

4）点样：加入3μlPCR扩增之后的DNA样品和1～3个Marker。

5）电泳：电压2 000V、电流200mA、功率120W（两块板）电泳1.5h（指示带跑完整个胶板）。

1.4.2.3 银染

电泳完毕之后，先将上槽液回收，取下胶板，小心分开两块胶板。将平板放入染色液中染色7min，将平板取出用蒸馏水清洗一下，然后放入显色液中，待胶显出条带后取出，为使染色和显影均匀，将染色液和显影液放在摇床上。将银染好的胶板读板并进行拍照记录。