茶多酚和维生素C清除亚硝酸盐反应的简化模型的构建

侯钟令,周才琼

(西南大学食品科学学院,重庆 400715)

茶多酚和维生素C清除亚硝酸盐反应的简化模型的构建

侯钟令,周才琼*

(西南大学食品科学学院,重庆 400715)

为弥补常见的表达亚硝酸盐清除能力的参数的不足以及深入研究清除反应的动力学过程,建立了茶多酚和维生素C清除亚硝酸盐的简化反应模型并推导出参数1/C0t0.5,其中C0为抗氧化剂浓度,t0.5为亚硝酸盐被半数清除所需时间,并设计实验对其进行验证。实验证实了在亚硝酸盐浓度变化时底物与清除剂不存在固定的物质的量的对应关系;而对于同一种抗氧化剂,底物浓度变化时参数1/C0t0.5的值不存在显著性差异;同时通过清除反应的动力学过程提出了“最大效率时间”的观点,即在该段时间内绝大多数亚硝酸盐被清除。参数1/C0t0.5同时将底物浓度和反应速率考虑在内，弥补了传统参数的不足；“最大效率时间”的观点对于提高亚硝酸盐清除剂的使用效率有一定指导作用。

茶多酚,维生素C,亚硝酸盐,反应模型,模型验证

亚硝酸盐广泛存在于各类食物中,除肉制品加工中为防腐和发色而适当添加之外,其存在往往是不利的,以腌制蔬菜为典型[1-2]。亚硝酸盐具有急性毒性,同时,含有硝酸盐或亚硝酸盐的食物成分在人体消化道的酸性环境中发生亚硝基反应,并与胺类物质合成具有强致癌性的N-亚硝基化合物[3-4]。因此,清除亚硝酸盐的研究对控制腌制食品加工过程亚硝酸盐的含量至关重要,也对膳食健康具有较好的指导作用。

研究表明常见的抗氧化剂对亚硝酸盐具有较好的清除作用,常用的抗氧化剂或有抗氧化性的提取物,如含多酚提取物[5-7]、植物多酚[8-11]和维生素[12]等对亚硝酸盐的清除能力得到了较为广泛的研究，并找到了上述物质清除一定浓度亚硝酸盐底物的最适浓度。目前常采用“最优清除浓度”和“半数清除浓度EC50”表征抗氧化剂清除亚硝酸盐能力。但笔者认为这两种参数均存在一定的不足。一是反应平衡时间未在参数中得以表现,而反应平衡时间显然也能够体现其清除能力;二是无法体现在整个清除反应过程可能存在的反应速率变化的情况,而速率的变化对应用清除反应和清除剂时的“效率”有显著影响。因此有必要从动力学的角度对清除作用的过程进行探究。

清除反应过程中,N的价态随着反应物浓度、反应条件等的不同而变化,具体的反应机理较为复杂,难以用方程式明确定量地描述[12]。实验选用研究较多的茶多酚(Tea Polyphenols,TP)和维生素C(Vitamin C,VC),考虑到清除剂清除亚硝酸盐后不应当生成为更加不适宜的物质——高浓度TP和VC均可抑制亚硝胺的生成,而低浓度TP反而会促进亚硝胺生成[13-15];同时以简化的思路考虑VC和清除剂的作用机理——当底物亚硝酸盐与清除剂浓度之比足够大时,反应中清除剂浓度相对变化小,可认为浓度近似恒定。由此,在人为设置的较高浓度清除剂条件下,对清除反应的描述可以简化为一次反应。本研究旨在探究和验证基于以上两点考虑所建立的模型是否可以正确地表征清除剂清除亚硝酸盐的能力,并通过探究反应的动力学过程以期找到某些具有指导作用的规律。

表1 实验组C1～C6加入的清除剂的体积数

注:编号a的实验组用于测定EC50,编号b的实验组用于测定最优清除浓度;C1～C3为TP实验组,C4～C6为VC实验组。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

NaNO2标准品,重庆市北碚区化学试剂厂;茶多酚 食品级,重庆青阳药业有限公司;维生素C 分析纯,重庆青阳药业有限公司。

FA2004A型电子天平 上海精天电子仪器有限公司;HH-2型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;721型分光光度计 上海第三分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 亚硝酸盐清除率 采用最常用的对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺法[6-9],通过反应前后亚硝酸盐溶液的吸光度之比计算清除率如下。

注:A1:未添加清除剂时反应液的吸光度;Ax:添加清除剂之后反应液的吸光度;A′x:清除剂吸光度本底。

1.2.2 亚硝酸盐清除反应模型建立

1.2.2.1 反应模型建立的原理 当清除反应被简化地看做一次反应时,易得到:

lnC=K0C0t

其中C和C0分别表示亚硝酸盐残余浓度和清除剂初始浓度,K0表示该反应的反应速率常数。测亚硝酸盐的残余量,则残余率y与C成正相关,即

lny=K1C0t

其中K1为反应速率常数经过换算后得到的比例系数。

取y=0.5即亚硝酸盐被半数清除令式子左边为常数。则参数C0t0.5为与反应速率常数有关的定值。为使参数值和清除能力大小同向变化,取其倒数得参数1/C0t0.5。从推导过程及参数的结构来看,参数中含有反应速率常数有关的定值,因此该参数能够表示出清除剂清除作用的强弱,同时参数中含有清除剂初始浓度以及反应时间,故又将清除剂浓度和反应速率考虑在内。

1.2.2.2 最优清除浓度和EC50的相关分析 参考李桂星[6]、吴守林[11]等的研究和预实验,配制不同浓度清除剂使用液和亚硝酸钠标准液,在一定体积的亚硝酸钠标准溶液中加入不同体积的清除剂使用液以得到不同浓度的清除剂溶液。加入亚硝酸钠标准液体积和清除剂体积见表1。加入5 mL pH=3.0的0.5 mol/L柠檬酸钠-盐酸缓冲液,加入纯水使反应溶液总体积为10 mL。37 ℃恒温水浴反应60 min。每个实验组均做3组平行实验、1组空白对照以及1组清除剂本底。

按照常用的方法计算EC50:作清除率-体积(ω-V)图,当ω=0.5时,得V0.5,则

EC50=V0.5·C/10

同时找到最优清除浓度:将清除率达到最大时对应的最小清除剂浓度(换算为加入的初始浓度),记做最优清除浓度。将底物浓度与最大清除率的积与最优清除浓度之比(乘以合适的系数以便于观察)记做清除效率。

1.2.2.3 参数1/C0t0.5验证实验 以TP为例,经预实验可知,体积分数为1%～4%的清除剂与底物反应时,满足清除剂与底物浓度之比足够大的条件,且底物浓度降低第一个对数周期(90%)所需时间适中(1～10 min)。选择上述浓度TP溶液50 mL分别与50 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液混合,并加入柠檬酸钠-盐酸和纯水缓冲液调节pH至3,以纯水补足反应液体积至150 mL。每隔一定时间取5 mL反应液进行比色。样品浓度和采样方案见表2。实际实验操作时先将清除剂、缓冲剂配制、纯水按量配置至总体积150 mL置于磁力搅拌器上,再加入1 mL 250 μg/mL亚硝酸钠标样,加入后立即计时。

VC同样经预实验测得适宜浓度,浓度见表2。按照同样的条件进行反应。

表2 实验组D1～D2清除剂浓度

1.2.2.4 清除速率变化情况的探究 结合预实验,设计出方案A和方案B两种取样方法,以确保准确性和效率的统一。方案A为前10 min每1 min取样一次,10～30 min每5 min取样一次,30～60 min每10 min取样一次;方案B仅为前10 min每1 min取样一次。具体应用见表2,对采用了取样方案A的实验组,绘制其ln y-t图像,以更加全面地探究亚硝酸盐清除率ω与反应时间之间可能存在的规律。

1.3 数据处理

数据初步整理(计算清除率)使用Excel 2016(Microsoft Corporation),以SPSS 22.0(IBM Co.Ltd)和MATLAB 2014b(Mathwork Lnc.)软件进行回归分析并以α=0.05的最小显著极差(LSR)法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 最优清除浓度和EC50存在的局限性

按照1.2.2.2实验设计进行实验,分别找到实验组C1～C6的最优清除浓度,计算EC50和清除效率。结果如表3所示。

表3 各组清除剂半数清除浓度(EC50)、最优清除浓度、清除效率

注：C1～C3组为茶多酚(TP)对应实验组，不同字母表示茶多酚组数据间差异显著(p<0.05)；C4～C6组为VC对应实验组，不同字母表示VC组数据间差异显著(p<0.05)。

对上述数据分析可见,TP和VC,浓度加倍和减半时(10 μg/mL变为5 μg/mL和20 μg/mL),它们的EC50和最优清除浓度并没有同样简单地加倍和减半。进而由“清除效率”这个量的计算方法可知其表征了清除剂与底物反应时物质的量的对应关系。TP和VC,浓度加倍和减半时,每个底物浓度对应的清除效率也有显著差异,表明上述两种清除剂与亚硝酸盐反应时,底物和清除剂的物质的量的对应关系随着浓度的改变而变化。因此,从反应物物质的量的对应情况来看,仅仅用浓度的相关参数表示抗氧化剂对亚硝酸盐的清除作用是不全面的。

2.2 模型验证

图1为分别设置不同的TP浓度时的lny-t曲线。取反应开始至清除率达到约90%(残余率的对数ln y=ln0.1≈-2.3)附近的点,可以看到曲线存在着较好的线性关系。这一线性关系符合一次反应的假设。当浓度增加时,曲线的斜率绝对值的显著增大即反应速率显著增大,这显然符合清除反应的原理。

图1 不同浓度的TP lny-t间图Fig.1 lny vs time of different concentration of TP

表4 各样品半数清除时间、趋势线方程斜率、相关系数(R2)和1/C0t0.5

注:同列相同字母表示无显著差异。

计算图1中各直线的斜率、相关系数,并将ln y=0.5代入直线方程求出半数清除时间,计算出参数1/C0t0.5如表4所示。当取TP浓度为0.1%和0.5%时,由相关系数可知该浓度下ln y与t不存在显著的线性相关关系。这证明清除剂的浓度不足以达到远大于亚硝酸盐浓度的水平时,一次反应的假设无法成立。对于其余组数据,取α=0.05,以LSR法对参数1/C0t0.5值分析可知,当清除剂浓度在一定范围内变化时,参数1/C0t0.5的值无显著差异。即新参数的值在该段时间内不随着清除剂浓度变化而变化。证明在适当的条件下,参数1/C0t0.5可以衡量清除剂对亚硝酸盐的清除效果,并且避免了EC50和最优清除浓度所具有的依赖底物浓度和忽视平衡时间的不足。

2.3 对清除率-时间的分析

将延长反应时间至60 min的实验组取较为典型的结果绘制ln y-t如图2所示。在清除率达到95%(残余率的对数ln y=ln0.05≈-3.0)附近后,图像出现了明显的转折点,转折之后的图线斜率绝对值显著减小,这与周才琼[16]的报道中的数据相吻合。针对转折点后的反应情况分析数据,转折点之后的较长一段时间(60 min)内,ln y与t仍然具有较显著的线性相关。直线斜率和相关系数见表5,在该段时间内,直线斜率绝对值较小,显示清除速率很小。

图2 延长反应时间后的TP各浓度lny-t间图Fig.2 lny vs time of different concentration of TP at extenden reaction time

样品浓度(%)斜率相关系数TP1.00-0.02150.96602.00-0.02070.95594.00-0.03280.9724VC2.00-0.01800.95144.00-0.01960.9647

分别将转折点前后的直线延长得到交点,计算出交点对应的反应时间、该时间对应的清除率ω1、该时间至60 min间清除率变化量Δω见表6。将两直线的交点即转折点所对应的时间定义为“最大效率时间(TMAX)”。可以看出,在TMAX之前的时间段内,清除速率较大,而TMAX之后的较长时间清除率难以增加。即在清除反应中,清除大部分底物所需的时间较短,而清除剩余部分底物则需要较长的时间。这可能是因为清除剂与底物反应的产物积累,以及反应物浓度的变化,对反应的继续进行有阻碍作用。

表6 不同浓度清除剂最大效率时间和清除率

3 结论与讨论

茶多酚和维生素C对亚硝酸盐的清除作用效果已得到了广泛认同。即在模拟胃液条件下茶多酚对亚硝酸盐的清除作用总体远大于VC[17-19]。本研究所得到的结果中,TP和VC的1/C0t0.5值的差异同样可以印证这一点。但这并不能否认其余研究中采用的方法和得到的结果的意义。

这一参数的理论推导过程揭示了它是与化学反应速率常数有关的一个量,即该参数是一个与清除剂本身物质结构与化学性质有关的量。本研究中该参数进行验证的过程中,采用了现实生产中一般不需用的较高浓度的清除剂,这一设计的目的是为了体现出清除剂本身的性质并且便捷地通过实验得出并验证参数1/C0t0.5的值,而非旨在以此种高浓度清除剂应到于实际生产中。在使用较低浓度的清除剂时,本研究基于简化的一次反应所建立的模型虽不再适用,但该参数1/C0t0.5所体现出的清除剂的固有性质同样存在。该参数可能能够推广到更多的抗氧化剂以表征它们对亚硝酸盐的清除作用并用于比较清除能力的差异,这有待于更加深入的研究。

目前普遍采用的EC50和最优清除浓度表示抗氧化剂对亚硝酸盐清除效果具有一定局限性。不仅在于其忽视了反应速率和对底物浓度有很大的依赖性。并且多数情况下清除剂与亚硝酸盐底物不存在简单的数量对应关系。参数1/C0t0.5同时将反应速率和清除剂浓度考虑在内,可以在一定程度上克服上述不足。通过对清除作用的动力学过程进行分析,提出了最大效率时间的观点:在清除反应中,清除大部分底物所需的时间较短,而欲清除剩余部分底物则需要的时间显著增加。这对亚硝酸盐清除剂的使用可能有一定的指导作用。

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A simplified model and it’s verification of nitrite scavenging reaction with tea polyphenols and vitamin C

HOU Zhong-ling,ZHOU Cai-qiong*

(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

To making up the shortage of commonly-used parameter for scavenging effect to nitrite,a simplified mathematical model of nitrite scavenging reaction with tea polyphenols and vitamin C was established and the parameter 1/C0t0.5on nitrite under certain conditions was derived,where C0was concentration of the antioxidants and t0.5was the time taken to eliminate half amount of nitrite. It’s proved that there isn’t a certen and constant magnitude relation among nitrite and scavenger when nitrite changes its concentration. However,significant difference of the value of 1/C0t0. 5was not found during the change. Meanwhile,a viewpoint,time of maximum efficiency,which means the majority of nitrite will be eliminated in a short time during the clear reaction,was put forward. The parameter 1/C0t0.5,which takes the concentration of reactant and the reaction rate into consideration, make up for the deficiency of commonly-used parameter,and the viewpoint,time of maximum efficiency might make contribute to the practical application.

tea polyphenols;vitamin C;nitrite;reaction model;model validation

2016-09-01

侯钟令(1995-)，男，本科生，研究方向：食品科学与工程，E-mail：lengchen95@gmail.com。

*通讯作者:周才琼(1964-)，女，博士，教授，主要从事食品营养化学相关教学与科研方面的研究，E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn。

西南大学食品科学学院(百超)创新项目。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.014