抗烟草黑胫病植物源活性物质的筛选

朱三荣，周佳民，巢 进，宋 荣，曹 亮，鲁耀雄，陈前锋，徐 瑞

(1.湖南省烟草公司 湘西自治州分公司，湖南 吉首 416000；2.湖南省农业科学院 农业生物资源利用研究所，湖南 长沙 410125)

抗烟草黑胫病植物源活性物质的筛选

朱三荣1，周佳民2*，巢 进1，宋 荣2，曹 亮2，鲁耀雄2，陈前锋1，徐 瑞2

(1.湖南省烟草公司 湘西自治州分公司，湖南 吉首 416000；2.湖南省农业科学院 农业生物资源利用研究所，湖南 长沙 410125)

为筛选对烟草黑胫病有较高抗性的植物源提取物，采用菌丝生长速率法，对苦参、枳壳等45种中药材粗提液对烟草黑胫病病菌的抑制效果及施药方式进行了分析，结果表明：有土黄连、黄柏等19种中药材的提取物对烟草黑胫病病菌菌丝生长有显著的抑制效果，中药材提取物以混合杀菌方式对烟草黑胫病菌丝生长抑制作用效果最好；其中土黄连、黄柏、黄独、厚朴、前胡、雷公藤、苍术、油茶饼、瞿麦、巴戟天等16种中药材的提取物对烟草黑胫病菌丝生长有极显著的抑制效果，具有开发先导化合物的潜力；在大田生产应用上，施用中药材植物源药剂防治烟草黑胫病以灌根的施药方式较好。

烟草；黑胫病；植物源药剂

烟草黑胫病(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是烟草生产上一种毁灭性土传真菌性病害之一[1]，可危害烤烟、晾烟、晒烟、香料烟、白肋烟等所有栽培烟草，破坏性极强。Van Breda de Haan于1896年在印尼爪哇烟草上发现[2]，1950年传入我国，随后扩散至全国大部分烟草种植区域[3]，给我国烟草产业造成了严重影响[4]。

化学防治仍然是防治烟草黑胫病最为有效的手段[5]，但化学农药的长期过量施用导致病原菌的抗药性增强，也直接影响了烟草产量和质量[6]。以中药材提取物为核心的植物源农药，具有易分解并且分解产物对环境友好的优点，有学者就中草药提取物对烟草黑胫病菌菌丝室内生长的抑制作用做了大量的研究[7-9]，但形成产品应用于生产上研究的报道很少。为此，本试验对烟草黑胫病具有抑制作用的中草药提取物进行了广泛的筛选，以期为研发植物源杀菌剂防治烟草黑胫病提供依据。

1 材料

1.1 供试菌株

供试烟草黑胫病病菌株由湖南农业大学植物病理教研室朱宏建博士鉴定提供。将菌种接种到PDK培养基(燕麦片：200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、CaCO35 g、水1000 mL)上，25 ℃黑暗培养7 d后，备用[10]。

1.2 供试药材及来源

供试药材主要是以消炎杀菌类药材为主，分别采自于湖南省农业科学院药用植物基地、道县、新宁、龙山等地，烘干或晾干备用，部分药材从湖南省廉桥药材市场购买，然后粉碎备用。所用药材经湖南省农业生物资源利用研究所药用植物课题组鉴定，具体见表1。

表1 供试中药材名录

1.3 提取物的制备

采用超声波提取法[11]。将阴干的植物材料在45 ℃恒温电热鼓风干燥箱中吹干至发脆，用植物粉碎机粉碎，过80目筛后备用。称取各植物样品干粉100.00 g，倒入电热套圆形瓶中，再倒入75%的酒精500 mL。开启电热套，提取60 min，温度设置为95 ℃。把提取液减压抽滤得滤液，残渣再次采取相同方法进行处理，重复提取3次，合并3 次滤液，把滤液倒入旋转蒸发仪圆形瓶中，减压旋转蒸发至膏状(旋转参数：60～75 r/min；蒸发温度60 ℃以下，制冷温度：-2～10 ℃)，即得到该药用植物的乙醇粗提物，把膏状物倒入瓶中，做好记载，贴好标签，写上编号名称，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4 生物测定方法

采用菌丝生长速率法生物测定技术进行测定[12]。先将提取物用5%乙醇溶解，配制成所需浓度备用，用打孔器在长满烟草黑胫病病原菌的培养基上切取菌饼，将菌饼放入提取物溶液中浸泡5 min，再转移到无菌空培养皿(直径90 mn)中，置于25 ℃恒温箱中培养至第3、5天时，分别计算黑胫病菌落直径，数据用DPS 7.05和Excel 2003软件进行数据分析和处理，方差分析采用LSD多重比较法进行。

2 结果与分析

2.1 不同药用植物的抗菌活性比较

45种药用植物提取物设置50和500倍2种浓度，以无菌水(T47)和5%乙醇(T46)作为对照，分别于第3和5天测量菌落直径。

由表2可知，与无菌水对照(T47)相比，在第3天，T44、T19、T12等42个50倍液处理的烟草黑胫病菌的菌落直径小，其中，有T44、T19、T12等32个处理的50倍液处理的烟草黑胫病菌的菌落直径差异极显著；在第5天，T44、T19、T33等40个处理差异极显著，

与乙醇对照(T46)的菌落直径相比，在第3天，T44、T19、T12等18个50倍液处理的烟草黑胫病菌的菌落直径差异极显著，尤其是以处理T44、T19、T12、T33、T34的效果明显，其菌落直径仅分别为0.58、0.65、0.75、1.12、1.35 cm；到了第5天，各处理的菌落直径的变化趋势和第3天基本一致。

处理第3天，与空白对照相比，乙醇对照的菌落直径要小，但没有差异，表明50倍液的乙醇有一定的杀菌效果，但没有显著差异，说明用乙醇作提取剂，对黑胫病菌菌丝的生长影响不大。

由表3可知，第5天， 50和500倍液2个处理浓度，空白对照与乙醇对照的菌落直径均没有差异，数据基本接近一致，说明在5天后，用乙醇作为提取剂对本试验的干扰较小。从表2、表3还可以看出，与乙醇对照相比，44种植物提取物的50倍溶液及32种植物提取物的500倍浓液都存在极显著的抑菌效果，尤其是以T44、T19、T33、T12、T31的效果最明显，其50倍稀释液处理的菌落直径仅分别为0.68、0.75、1.27、1.62、2.10 cm，说明随着时间的推迟，中药材提取物的杀菌效果显著。

与无菌水对照(T47)相比，在第3天，有T12、T34、T21等33个处理的500倍液的菌落直径小，其中，有T12、T34、T21等23个处理差异极显著；在第5天，有T31、T12、T21等33个处理差异极显著。与乙醇对照(T46)的菌落直径相比，第3天，有T44、T19、T12等11个处理差异极显著，尤其是以处理T44、T19、T12、T33、T34的效果最明显，其菌落直径仅分别为0.58、0.65、0.75、1.12、1.35 cm；到了第5天，各处理菌落直径的变化趋势与第3天基本一致。

综合来看，与乙醇对照(T46)的菌落直径相比，各处理的50倍和500倍液对黑胫病病菌有较好抑制作用的处理有T44、T19、 T12、T33、T34、T31、T25、T42、T37、T30、T23、 T32、T11、T17、T20、T21等16个。

2.2 5种植物提取物不同浓度对黑胫病菌的抑制效果

根据室内测定结果，本试验选取了T44、T19、 T12、T33、T34等5种药用植物提取物，设置了25、50、100等6个梯度的药剂浓度试验。结果表明，各梯度浓度的植物提取液对黑胫病病菌均有一定的抑制效果，随着稀释倍数的成倍降低，菌落直径均呈下降趋势，但没有成相应的倍数下降(表4)，T44、T19、 T12、T33、T34等药用植物提取物2000倍液的菌落直径均比对应的1000倍液的菌落直径要大，且均存在极显著差异(T19显著差异)，各处理1000倍液的菌落直径与500倍液的菌落直径没有极显著差异(T12极显著差异)，各处理500倍液的菌落直径明显比100倍液的菌落直径要大(T19没有显著差异)，各处理100倍液的菌落直径比50倍液的菌落直径要大，且均有极显著差异(T12除外)，各处理25倍液的效果最好，菌落直径均小于(含等于)1.5 cm，但与50倍液相比，T12、T19、T44间差异不显著，且各处理均未达到极显著差异。

与乙醇对照相比，在同一梯度浓度上，植物提取物的菌落直径呈下降趋势，这说明植物提取液对黑胫病病菌均有一定的抑制效果，随着稀释倍数的减低，杀菌效果逐渐增强；在本试验设置的20～2000倍液6个浓度梯度中，表现出来的4个档次：25倍液与50倍液的抑菌效果相当，100倍液、500倍液与1000倍液的抑菌效果相当，2000倍液的抑菌效果最差，这为生产实际中的施药浓度设置提供借鉴。

表2 不同药用植物提取物50倍溶液对烟草黑胫病菌的菌落直径cm

处理第3天菌落直径差异显著水平0．050．01处理第5天菌落直径差异显著水平0．050．01T55．23aAT467．90aAT65．23aAT477．80aAT34．70abABT87．30abABT474．63abcABT17．28abcABT14．57abcABT107．28abcABT84．55abcABT47．23abcABT104．35bcdBCT37．18bcdBCT134．30bcdeBCT67．13bcdeBCT44．28bcdeBCT97．08bcdeBCT434．00bcdefBCDT26．88bcdefBCDT243．95bcdefgBCDET76．70bcdefgBCDET23．92bcdefgBCDET56．18bcdefgBCDET453．90cdefghBCDEFT396．13cdefghBCDEFT463．87cdefghiBCDEFT386．05cdefghiBCDEFT93．85cdefghiBCDEFT405．97cdefghiBCDEFT413．62defghijCDEFGT425．95defghijCDEFGT263．60defghijCDEFGHT145．93defghijCDEFGHT223．55efghijCDEFGHIT365．73efghijCDEFGHIT153．37fghijkDEFGHIJT435．13fghijkDEFGHIJT273．32fghijklDEFGHIJT204．95fghijklDEFGHIJT353．22fghijklmDEFGHIJT284．90fghijklmDEFGHIJT383．22fghijklmDEFGHIJT134．75fghijklmDEFGHIJT283．22fghijklmDEFGHIJT414．55fghijklmDEFGHIJT73．18ghijklmDEFGHIJKT174．48ghijklmDEFGHIJKT393．18ghijklmDEFGHIJKT454．40ghijklmDEFGHIJKT363．18ghijklmDEFGHIJKT264．38ghijklmDEFGHIJKT293．12hijklmEFGHIJKLT244．38hijklmEFGHIJKLT403．10ijklmnEFGHIJKLT164．32ijklmnEFGHIJKLT163．03jklmnoFGHIJKLMT154．28jklmnoFGHIJKLMT182．88jklmnopGHIJKLMT184．13jklmnopGHIJKLMT142．73klmnopqHIJKLMNT224．13klmnopqHIJKLMNT212．72klmnopqIJKLMNT293．83klmnopqIJKLMNT202．67klmnopqJKLMNOT273．82klmnopqJKLMNOT172．60klmnopqrJKLMNOT373．75klmnopqrJKLMNOT112．55lmnopqrJKLMNOT233．75lmnopqrJKLMNOT322．50mnopqrJKLMNOT353．22mnopqrJKLMNOT232．32nopqrKLMNOPT303．13nopqrKLMNOPT302．28opqrLMNOPT112．97opqrLMNOPT372．22pqrsMNOPQT322．82pqrsMNOPQT421．97qrstNOPQRT212．82qrstNOPQRT251．82rstuOPQRT342．58rstuOPQRT311．45stuvPQRST252．33stuvPQRST341．35tuvwQRST312．10tuvwQRST331．12uvwRST121．62uvwRST120．75vwST331．27vwST190．65wST190．75wST440．58wST440．68wS

注：同列数据后的大、小写字母分别表示差异达0.01、0.05的显著水平。下同。

3 结论

以植物为原料进行植物源农药的研制与开发已成为世界各国农药研发的热点。我国中草药研究历史悠久，中草药资源十分丰富，在筛选具有杀菌活性物质的中药材品种上有明显优势，植物源农药研发中最基础也最为重要的工作就是进行活性植物资源筛选[13-15]。

表3 不同药用植物提取物500倍溶液的烟草黑胫病菌菌落直径cm

处理第5天菌落直径差异显著水平0．050．01处理第5天菌落直径差异显著水平0．050．01T65．35aAT477．93aAT425．17abABT467．70abABT75．08abcABCT107．53abcABCT45．02abcdABCT437．48abcdABCT24．97abcdABCDT427．43abcdABCDT414．92abcdABCDT87．42abcdABCDT34．88abcdeABCDT67．38abcdeABCDT394．85abcdeABCDT47．35abcdeABCDT14．80abcdeABCDET17．35abcdeABCDET254．77abcdeABCDEFT387．33abcdeABCDEFT84．75abcdeABCDEFGT97．30abcdeABCDEFGT474．65abcdefABCDEFGHT37．25abcdefABCDEFGHT54．45bcdefgABCDEFGHIT407．12bcdefgABCDEFGHIT154．42bcdefghABCDEFGHIJT77．12bcdefghABCDEFGHIJT404．28bcdefghiBCDEFGHIJKT367．08bcdefghiBCDEFGHIJKT94．27cdefghiBCDEFGHIJKT27．00cdefghiBCDEFGHIJKT454．25cdefghijBCDEFGHIJKT396．97cdefghijBCDEFGHIJKT464．15defghijkCDEFGHIJKLT56．60defghijkCDEFGHIJKLT104．02efghijklDEFGHIJKLMT136．10efghijklDEFGHIJKLMT384．00efghijklDEFGHIJKLMT206．00efghijklDEFGHIJKLMT373．85fghijklmEFGHIJKLMT375．83fghijklmEFGHIJKLMT363．78fghijklmFGHIJKLMNT165．57fghijklmFGHIJKLMNT273．77fghijklmGHIJKLMNT225．55fghijklmGHIJKLMNT333．67ghijklmnHIJKLMNOT265．52ghijklmnHIJKLMNOT293．57ghijklmnoIJKLMNOPT245．45ghijklmnoIJKLMNOPT223．55hijklmnoIJKLMNOPT345．37hijklmnoIJKLMNOPT183．52ijklmnoIJKLMNOPQT445．35ijklmnoIJKLMNOPQT173．50ijklmnopIJKLMNOPQT155．33ijklmnopIJKLMNOPQT353．47ijklmnopqIJKLMNOPQT235．23ijklmnopqIJKLMNOPQT163．47ijklmnopqIJKLMNOPQT285．20ijklmnopqIJKLMNOPQT433．43ijklmnopqrJKLMNOPQT455．18ijklmnopqrJKLMNOPQT443．40ijklmnopqrKLMNOPQT415．15ijklmnopqrKLMNOPQT263．37jklmnopqrKLMNOPQT355．13jklmnopqrKLMNOPQT133．37jklmnopqrKLMNOPQT275．08jklmnopqrKLMNOPQT143．32klmnopqrKLMNOPQRT184．95klmnopqrKLMNOPQRT243．22lmnopqrsLMNOPQRT294．85lmnopqrsLMNOPQRT193．03mnopqrsMNOPQRT194．80mnopqrsMNOPQRT202．85nopqrsNOPQRT174．78nopqrsNOPQRT322．77opqrsOPQRT114．77opqrsOPQRT232．70opqrsOPQRT254．70opqrsOPQRT302．62pqrsPQRT144．13pqrsPQRT312．62pqrsPQRT333．47pqrsPQRT112．60qrsPQRT303．27qrsPQRT282．55rsQRT323．22rsQRT212．55rsQRT213．13rsQRT342．55rsQRT123．02rsQRT122．37sRT312．92sR

本试验广泛筛选的45种中药材中，土黄连、黄柏、黄独、厚朴、前胡、雷公藤、苍术、油茶饼、瞿麦、巴戟天等16种中药材的提取物对烟草黑胫病菌丝生长有很好的抑制效果，钟慧等[16]的研究表明，苍术甲醇提取物对烟草黑胫病菌有很高的抑菌活性；王若焱[17]等研究认为，青蒿、藿香等 8 种植物提取液联合保健处理烟草黑胫病具有较好的防治效果；王强[18]等研究表明，厚朴、黄连等中药材也具有一定的抑菌作用；本试验中选取的药材资源丰富且均可人工栽培，因此，具有开发先导化合物的潜力。

表4 提取物不同梯度浓度菌落直径变化cm

提取物浓度/倍数处理T12T19T33T34T44乙醇(CK)20006．63aA4．53aA4．63aA6．97aA6．07aA6．60aA10006．37bA3．53bAB3．53bB3．73bB3．67bB6．43aA5002．43cB2．83bcBC3．27cB3．73bB3．20bB4．60bB1000．57dC2．33cC1．57dC2．53cC2．07cC4．33bcBC500．53dC0．70dD0．80eD1．83dD0．87dD4．13bcBC250．50dC0．50dD0．53fD1．50eD0．72dD3．87cC

本试验表明，土黄连、黄柏、黄独、厚朴、前胡、雷公藤、苍术、油茶饼、瞿麦、巴戟天等植物提取液对黑胫病病菌均有一定的抑制效果，药用植物提取物的抑菌效果随着稀释倍数的减低，抑菌效果逐渐增强，这与王树桐[19]等就中草药丁香提取物对香蕉镰刀菌枯萎病病原菌的抑菌试验结果基本一致。本试验中药用植物提取物6个浓度梯度的抑菌效果表现出来4个档次，依次为：稀释25倍液与50倍液的效果相当，100倍液、500倍液与1000倍液的抑菌效果相当，2000倍液的抑菌效果最差，因此，考虑到中药材植物源药剂提取成本及提取材料的来源，在生产实践中建议用500倍液较为合适。中国中药材资源丰富，本试验仅仅测定45种中草药提取物在室内的抑菌效果，而且抑菌效果受其功能性成分复配及大田环境因素的影响，抑菌机制等还需进一步研究，本课题组正在加强此方面的试验研究，以期为烟草黑胫病的防治提供一些对策。

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(责任编辑：曾小军)

Screening of Botanical Active Substances Resistant to TobaccoBlack Shank (Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)

ZHU San-rong1, ZHOU Jia-min2*, CHAO Jin1, SONG Rong2,CAO Liang2, LU Yao-xiong2, CHEN Qian-feng1, XU Rui2

(1. Xiangxi Autonomous Prefecture Branch, Tobacco Company of Hunan Province, Jishou 416000, China; 2. Institute of Agricultural Biological Resource Utilization, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China)

In order to screen out the botanical active substances which had a stronger resistance to tobacco black shank (Phytophthoraparasiticavar.nicotianae), by using mycelium growth rate method, we determined the inhibitory effects of 45 kinds of Chinese herbal medicine crude extracts on tobacco black shank pathogen, and studied their application method. The results showed that the crude extracts from 19 kinds of Chinese herbal medicines (such asCoptischinensis,Phellodendronchinense) had a significant inhibitory effect on the mycelial growth of tobacco black shank pathogen, and the inhibitory effect of the mixed extracts from several Chinese herbal medicines was the best. The crude extracts from 16 kinds of Chinese herbal medicines (includingCoptischinensis,Phellodendronchinense,Dioscoreabulbifera,Mangnoliaofficinalis, common hogfennel root,Tripterygiumwilfordii,Rhizomaatractylodis, cake of oil-tea camellia,Dianthussuperbus,Morindaofficinalis, etc.) had a very significant inhibitory effect on the mycelial growth of tobacco black shank pathogen, and they had the potential to develop lead compounds. In the field production of tobacco, the better application mode of medicinal botanical pesticides for the control of tobacco black shank was root-irrigation.

Tobacco; Black shank; Botanical pesticide

2016-10-23

湖南省湘西自治州烟草专卖局科技项目(XX14-16Aa03)；公益性行业(农业)科研专项(201303117)。

朱三荣(1978─)，男，湖南双峰人，农艺师，硕士，主要从事烟草营养与栽培研究。*通讯作者：周佳民。

S572

A

1001-8581(2017)04-0063-06