农抗702诱导水稻抗瘟性对水稻丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响

胡 能,涂晓嵘,李昆太,刘泳糠,郭阿敏,涂国全,黄 林

(江西农业大学 生物科学与工程学院,江西 南昌 330045)

农抗702诱导水稻抗瘟性对水稻丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响

胡 能,涂晓嵘,李昆太,刘泳糠,郭阿敏,涂国全*,黄 林*

(江西农业大学 生物科学与工程学院,江西 南昌 330045)

在水稻品种陆两优996三叶一心时,分别喷施15 μg/mL农抗702、15 μg/mL井冈霉素、蒸馏水,在喷雾48 h后接种稻瘟病菌，以只喷蒸馏水、不接种稻瘟病菌为空白对照，研究了农抗702诱导抗瘟性对水稻丙二醛(MDA)含量及5种抗氧化酶活性的影响。研究结果表明:与空白对照相比,农抗702处理、井冈霉素处理和只接种稻瘟病菌处理的水稻叶片中MDA含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、脂氧合酶(LOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均有所提高，其中农抗702处理的水稻MDA含量以及SOD、CAT和POD活性在早期显著高于只接种稻瘟病菌处理的,且APX和LOX活性上升速度及峰值高度也均高于后者的;农抗702处理的诱导抗瘟性效果能够达到或超过井冈霉素处理的。

农抗702;水稻;稻瘟病;抗氧化酶;丙二醛

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)引起的、最具破坏性的水稻病害之一。据估计,稻瘟病引起的减产粮食至少能够养活600万人,造成的经济损失高达700亿美元[1]。目前,稻瘟病的防治措施主要包括化学杀菌剂的应用和抗病品种的选育[2]。然而,残留的化学物质可能会导致环境污染并对非靶标生物产生不利影响;由于真菌的遗传变异性高,抗性品种也容易丧失对病菌的抗性[2-3]。因此如何有效地防治稻瘟病仍是一个亟待解决的重要问题[4]。

诱导系统抗性(Induced systemic resistance, ISR)是由局部感染或激发子(包括各种有机物、无机物、微生物及其产物)诱导植物对病菌和害虫产生非特异性、广谱性的系统抗性的现象[5-6]。国内外大量研究表明,利用植物的诱导抗性能够有效提高水稻对稻瘟病的抗性。据Ueno M等[7]报道,水稻经吲哚乙酸及其衍生物处理后,其对稻瘟病的抗性得到了有效提高。Someya N等[8]以拮抗粘质沙雷菌菌株B2进行叶面喷雾处理,能够有效诱导水稻的抗瘟性。徐沛东等[9]研究表明,经烯丙苯噻唑叶面喷雾处理的水稻幼苗防御酶活性升高,稻瘟病抗性增强。

本课题组首次以土壤中分离筛选到的链霉菌702产生的新型多烯大环内酯抗生素农抗702,诱导了水稻对稻瘟病的抗性[9]。研究结果表明[9],在水稻7个不同生长发育期分别对水稻叶片喷施浓度为15 μg/mL的农抗702,均能有效地诱导水稻对稻瘟病的抗性，且在喷施农抗702 48 h后接种稻瘟病菌的诱抗效果最佳,高达60.31%。然而,在农抗702诱导水稻抗瘟性的稻瘟病菌-植物互作过程中,是否会对水稻叶片内MDA含量和抗氧化酶活性产生影响,目前尚不清楚。因此,我们对经农抗702诱导抗瘟性的水稻叶片内MDA含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、脂氧合酶(LOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的变化进行了研究，以期揭示农抗702提高水稻抗稻瘟性的生理生化机制,为新型病害的防治研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻:陆两优996，为高感稻瘟病品种,购自北京金色农华种业技术股份有限公司。稻瘟病菌菌株由江西省农科院植保所提供。供试90%农抗702(Agro-antibiotics 702)由本研究室自行制备。60%井冈霉素可湿性粉剂购自江苏擎宇化工科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 供试药液的配制 准确称取90%农抗702 111.11 mg、60%井冈霉素可湿性粉剂166.67 mg,分别置于容量瓶中，用100 mL无水乙醇定容至刻度,即成1 mg/mL农抗702及井冈霉素母液,在4 ℃冰箱遮光保存。试验时用无菌蒸馏水稀释成15 μg/mL溶液,现配现用。

1.2.2 水稻培养 将水稻种子浸于75%乙醇中3 min,然后用无菌蒸馏水冲洗3次,在28 ℃培养箱浸种24 h,催芽48 h。将水稻种子以2 cm×2 cm的间距播种于水稻盆(20 cm×30 cm×10 cm)中,播种后放于温室房中,控温(28 ±1)℃。试验设3个处理,每个处理60株,3次重复。

1.2.3 农抗702诱导水稻抗瘟性对脂膜过氧化防御酶活性的影响 待水稻生长至3叶1心时,分别用15 μg/mL农抗702、15 μg/mL井冈霉素、蒸馏水喷雾水稻叶片,在喷雾48 h后接种稻瘟病菌，分别记为处理A(农抗702+M.grisea)、处理B(井冈霉素+M.grisea)、处理C(蒸馏水+M.grisea)；以只喷蒸馏水、不接种稻瘟病菌为空白对照(CK)。在喷施药剂后,每24 h收集各处理组水稻的第二片叶,在8 d内分别测定各处理组水稻叶片中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、脂氧合酶(LOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性，以及丙二醛(MDA)的含量。

1.3 测定项目

MDA的提取和含量测定方法参照文献[10],MDA含量单位为mmol/(g FW);SOD的提取和酶活测定方法参照文献[11],酶活单位为U/(g FW);CAT的提取和酶活测定方法参照文献[11],酶活单位为U/(g FW);POD的提取和酶活测定方法参照文献[11],酶活单位为μg/(g·h);LOX的提取和酶活测定方法参照文献[12],酶活单位为ΔOD/(g·min);APX的提取与酶活测定方法参照文献[13],酶活单位为U/(g FW)。

1.4 数据统计与分析

利用Excel、Origin、DPS对实验数据进行统计、整理、分析和作图。

2 结果与分析

2.1 农抗702诱导水稻抗瘟性对MDA含量的影响

从图1可以看出,处理A、B、C水稻的MDA含量均高于空白对照的。农抗702处理24 h后,水稻MDA含量迅速上升并在72 h时达到峰值2.80 mmol/g,比空白对照增加48.94%；之后MDA含量下降并与空白对照相差不大。井冈霉素处理后水稻MDA含量的变化趋势与农抗702处理一致,72 h时的峰值为2.39 mmol/g,比空白对照增加27.13%。只接种稻瘟病菌处理(处理C)的水稻MDA含量在24 h开始上升,120 h时达到峰值2.14 mmol/g,比空白对照增加11.46%。与只接种稻瘟病菌相比,农抗702处理水稻后MDA含量在早期升高速度更快,幅度更大，且农抗702的效果优于井冈霉素的。

2.2 农抗702诱导水稻抗瘟性对SOD和CAT活性的影响

由图2可知,经农抗702处理和井冈霉素处理的水稻SOD和CAT活性均显著提高,而只接种稻瘟病菌处理和空白对照的水稻SOD和CAT活性差别不大。经农抗702处理后,水稻SOD和CAT活性均迅速升高,分别在48、24 h时达到最大值980.57、74.47 U/g,分别较空白对照增加38.07%、34.50%；随后分别在72～120 h和72～144 h期间保持显著高于空白对照的相对稳定水平；此后下降。经井冈霉素处理后,水稻SOD和CAT活性的变化趋势与农抗702处理基本一致,在48、24 h时的峰值分别为1024.01、69.03 U/g,分别高于空白对照44.19%、24.67%。整体上,农抗702处理的水稻SOD和CAT活性在24～168 h期间始终高于只接种稻瘟病菌处理的,且与井冈霉素处理相当。

2.3 农抗702诱导水稻抗瘟性对POD活性的影响

如图3所示:处理A、B、C水稻的POD活性均逐渐升高,并均在144 h时达到峰值,峰值分别为1315.83、961.11、761.61 μg/(g·min)，分别比空白对照CK高195.00%、115.00%、70.49%;与其他处理相比,农抗702处理(处理A)的水稻POD活性上升更快,幅度更大,诱导效果更好。

2.4 农抗702诱导水稻抗瘟性对APX活性的影响

由图4可知,处理A、B、C水稻的APX活性与CK相比均有不同程度的提高。具体而言，经农抗702处理和井冈霉素处理水稻的APX活性均在喷药后开始上升,并在72 h时开始快速上升，在96 h时到达峰值,分别为235.50、159.67 U/g,分别比空白对照增加了597%和373%;只接种稻瘟病菌处理的水稻的APX活性则在48 h时开始上升,并在96 h时出现

最大值93.42 U/g,比空白对照增加了177%；农抗702处理的水稻APX活性在各个时间段均高于只接种稻瘟病菌处理的,且开始上升的时间提前,活性提高更明显。

“*”表示在同一时间点处理A与处理C间在0.05水平下差异显著；“×”表示在同一时间点处理B与处理C间在0.05水平下差异显著。下同。

图1 各处理水稻叶片内丙二醛含量的变化

图2 各处理水稻叶片内SOD和CAT活性的变化

图3 各处理水稻叶片内POD活性的变化

2.5 农抗702诱导水稻抗瘟性对LOX活性的影响

各处理的水稻LOX活性变化如图5,在48 h内均没有明显变化；处理A、B、C水稻的LOX活性在48 h后开始迅速上升，且变化趋势一致,均在72 h时出现峰值，峰值分别为0.9739、0.6803、0.6214 △OD/(g·min)，分别高于空白对照742%、488%、437%；农抗702处理和井冈霉素处理在48～168 h期间的LOX活性始终高于只接种稻瘟病菌处理的;与井冈霉素处理相比,农抗702处理水稻的LOX活性在早期上升速度更快,酶活更高。

3 讨论

本课题组研究发现,在用15 μg/mL的农抗702喷施3叶1心期水稻后48 h接种稻瘟病菌,能够有效地诱导水稻对稻瘟病的抗性,显著降低水稻的染病率及病情指数，且最佳诱抗效果高达60.13%[9]。已有研究表明，井冈霉素能够诱导水稻抗病相关防御酶活性及病程相关蛋白含量的增加,并增强水稻对纹枯病的抗性[14-15]。本研究结果表明：经农抗702+接种稻瘟病菌处理后,水稻的MDA含量以及SOD、CAT和POD活性在早期显著高于只接种稻瘟病菌处理的,且APX和LOX活性上升速度及峰值高度均高于只接种稻瘟病菌处理的;农抗702处理对水稻MDA含量及抗氧化酶活性的提升效果能够达到或超过井冈霉素处理的效果。

图4 各处理水稻叶片内APX活性的变化

图5 各处理水稻叶片内LOX活性的变化

丙二醛(MDA)被确认是膜脂过氧化的产物,其含量是脂质过氧化作用强弱的一个重要指标[18]。脂氧合酶LOX能够通过非酶促和酶促的方式直接攻击植物膜系统,是启动膜脂过氧化的主要原因之一[19]。李云锋等[19]研究表明,用GP66激发子处理水稻后,非亲和性互作水稻的LOX活性和MDA含量的高峰期和强度在早期明显高于亲和性互作水稻。本研究结果表明,相对于只接种稻瘟病菌处理,农抗702+接种稻瘟病菌处理能显著提高水稻的LOX活性,并在早期快速提高MDA含量，说明增强水稻对稻瘟病的抗性与LOX活性的增强呈正相关。该结果与张智慧等[20]的研究结果一致。

APX通过抗坏血酸-谷肤甘肤循环催化H2O2生成H2O和单脱氢抗坏血酸,从而清除H2O2，降低活性氧对植物的伤害[21]。余泽高等[22]研究表明,小麦APX的活性随病情指数的增加而增强,且与小麦的水平抗性呈正相关。本研究发现,经农抗702+接种稻瘟病菌处理的水稻的APX活性显著高于只接种稻瘟病菌处理的,且喷施农抗702后水稻稻瘟病病情指数的下降与APX活性的升高呈正相关。该结果与余泽高等[22]的研究结果一致。

SOD、CAT、POD是保护细胞免受活性氧毒害的主要抗氧化酶,SOD能够催化O2-转化成H2O2和O2,POD与CAT可以清除水稻内过量的H2O2[23];此外,POD还参与植保素、木质素的合成代谢[24-26]。在本研究中，经农抗702、井冈霉素处理以及接种稻瘟病菌处理的水稻SOD、CAT和POD活性均有所提高,从而在不同程度上降低了活性氧对水稻的伤害。钟丽娟等[27]研究表明,喷施四霉素后接种稻瘟病菌,水稻叶片的SOD活性与对照相比差异并不显著。本研究结果显示,农抗702能够在早期显著提高水稻SOD的活性,SOD活性的增强与水稻抗瘟性呈正相关,该结果与李云锋等[19]的研究结果一致，而与钟丽娟等[27]的研究结果不同。李莉等[28]研究表明,β-氨基丁酸能够诱导水稻CAT、POD和PAL活性快速增加,增强水稻抵御稻瘟病菌入侵的能力。肖军等[29]以内生菌醇提取物诱导水稻抗瘟性后,水稻CAT活性却低于接种病菌对照的。在本研究中,相比于只接种稻瘟病菌处理,农抗702+接种稻瘟病菌处理能够快速显著提高水稻的CAT和POD活性,增强水稻对稻瘟病的抗性。该结果与李莉等[28]的研究结果一致，而与肖军等[29]的研究结果不同。

近年来,在各种激发子如何有效诱导水稻抗瘟性研究方面已经取得了相当可观的进展。然而由于对诱导系统抗性的了解尚不全面,目前诱导抗性的研究进展仅仅停留在发现阶段，这使得水稻诱导抗性在稻瘟病防治上的开发、应用及商业产业化受到了制约。因此，笔者研究了农抗702诱导水稻抗瘟性对其MDA含量和抗氧化酶活性的影响。然而,诱导抗性的机制是多因素的、复杂的。为了进一步阐明农抗702诱导水稻抗瘟性的生理生化机制，今后有必要深入研究农抗702诱导水稻产生了何种病程相关蛋白、抗菌类物质及其诱导产生的含量,以及相关基因的表达。

致谢：衷心感谢江西省农业科学院植物保护研究所兰波先生为本研究提供了稻瘟病菌菌株。

[1] Miah G, Rafii M Y, Ismail M R, et al. Blast resistance in rice: a review of conventional breeding to molecular approaches [J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40(3): 2369-2388.

[2] Namai T. Race differentiation of the rice blast fungus,Pyriculariaoryzae, and environmentally friendly control of rice blast disease [J]. Journal of General Plant Pathology, 2011, 77(6): 350-353.

[3] Ng L C, Sariah M, Sariam O, et al. Bio-efficacy of microbial-fortified rice straw compost on rice blast disease severity, growth and yield of aerobic rice[J]. Australasian Plant Pathology, 2012, 41(5): 541-549.

[4] Caracuel-Rios Z, Talbot N J. Cellular differentiation and host invasion by the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J]. Current Opinion in Microbiology, 2007, 10: 339-345.

[5] Tuzun S. The relationship between pathogen-induced systemic resistance (ISR) and multigenic (horizontal) resistance in plants [J]. European Journal of Plant Pathology, 2001, 107(1): 85-93.

[6] Kuc J. Concepts and direction of induced systemic resistance in plants and its application [J]. European Journal of Plant Pathology, 2001, 107(1): 7-12.

[7] Ueno M, Kumura Y, Ueda K, et al. Indole derivatives enhance resistance against the rice blast fungusMagnaportheoryzae[J]. Journal of General Plant Pathology, 2011, 77(3): 209-213.

[8] Someya N, Nakajima M, Hibi T, et al. Induced resistance to rice blast by antagonistic bacterium,Serratiamarcescensstrain B2 [J]. Journal of General Plant Pathology, 2002, 68(2):177-182.

[9] 徐沛东,常冬冬,兰波,等.烯丙苯噻唑对水稻主要防御酶活性的影响及其对稻瘟病的防治效果[J].华中农业大学学报,2014(4):60-65.

[10] Xiong Z Q, Zhang Z P, Li J H, et al. Characterization ofStreptomycespadanusJAU4234, a producer of actinomycin X2, fungichromin, and a new polyene macrolide antibiotic[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(2): 589-592.

[11] 胡能,杨帅,雷志火,等.农抗702诱导水稻抗瘟性研究[J].江苏农业科学,2016,44(8):158-161.

[12] Zhang H, Jiang Y, He Z, et al. Cadmium accumulation and oxidative burst in garlic (Alliumsativum) [J]. Journal of Plant Physiology, 2005, 162(9): 977-984.

[13] Li Y, Zhang S, Jiang W, et al. Cadmium accumulation, activities of antioxidant enzymes, and malondialdehyde (MDA) content inPistiastratiotesL. [J]. Environmental Science & Pollution Research International, 2013, 20(2):1117-1123.

[14] 姚锋先,曾晓春,蒋海燕,等.水稻中以亚麻酸为底物的脂氧合酶活性测定[J].江西农业大学学报,2006,28(2):183-186.

[15] 赵志祥,刘二明,黄红梅,等.防御酶在水稻抗瘟性中的作用[J].湖南农业大学学报:自然科学版,2007,33(6):744-746.

[16] 张穗,郭永霞,唐文华,等.井冈霉素A对水稻纹枯病菌的毒力和作用机理研究[J].农药学学报,2001,3(4):31-37.

[17] 张穗,赵清华,唐文华,等.井冈霉素A对水稻抗性相关酶活性的影响[J].植物保护学报,2003,30(2):177-180.

[18] Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance [J]. Trends in Plant Science, 2002, 7(9): 405-410.

[19] 李云锋,王振中.稻瘟菌GP66激发子诱导的水稻膜脂过氧化及其保护酶活性变化[J].植物病理学报,2005,35(1):43-48.

[20] 张智慧,聂燕芳,何磊,等.外源茉莉酸甲酯诱导水稻抗瘟性相关防御酶和内源水杨酸的变化[J].植物病理学报,2010,40(4):395-403.

[21] 张维静,陆海,杜希华.抗坏血酸过氧化物酶在植物抵抗氧化胁迫中的作用[J].山东师范大学学报:自然科学版,2008,23(4):113-115.

[22] 余泽高,乔丽雅.小麦抗坏血酸氧化酶活性与抗病性关系的初步探讨[J].湖北农业科学,2003(1):31-33.

[23] Paranidharan V, Palaniswami A, Vidhyasekaran P, et al. Induction of enzymatic scavengers of active oxygen species in rice in response to infection byRhizoctoniasolani[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2003, 25(1): 91-96.

[24] Dazy M, Masfaraud J F, Férard J F. Induction of oxidative stress biomarkers associated with heavy metal stress inFontinalisantipyreticaHedw. [J]. Chemosphere, 2009, 75(3): 297-302.

[25] Chiang A N, Wu H L, Yeh H, et al. Antioxidant effects of black rice extract through the induction of superoxide dismutase and catalase activities [J]. Lipids, 2006, 41(8): 797-803.

[26] Kotchoni S O, Gachomo E W. The reactive oxygen species network pathways: an essential prerequisite for perception of pathogen attack and the acquired disease resistance in plants [J]. Journal of Biosciences, 2006, 31(3): 389-404.

[27] 钟丽娟,赵新海,张庆华,等.四霉素诱导水稻对稻瘟病的抗性研究[J].安徽农业科学,2010,38(12):6263-6264.

[28] 李莉,刘振蛟,郭晓莉,等.β-氨基丁酸诱导水稻抗稻瘟病与植株防御酶活性的变化[J].江苏农业科学,2011,39(2):185-186.

[29] 肖军,杨镇,陈珣,等.内生菌醇提取物对水稻抗稻瘟病的诱导作用[J].中国生物防治学报,2015,31(3):433-438.

(责任编辑:黄荣华)

Influences of Rice Blast Resistance Induced by Agro-antibiotic702 on Content of Malondialdehyde and Activity ofAntioxidant Enzymes in Rice Plants

HU Neng, TU Xiao-rong, LI Kun-tai, LIU Yong-kang, GUO A-min, TU Guo-quan*, HUANG Lin*

(College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In order to explore the influences of rice blast resistance induced by agro-antibiotic 702 on the content of malondialdehyde (MDA) and the activities of 5 kinds of antioxidant enzymes in rice plants, we respectively sprayed 15 μg/mL agro-antibiotic 702, 15 μg/mL Jinggangmycin or distilled water upon rice variety Luliangyou 996 with four leaves, and inoculated rice plants with the pathogens of rice blast 48 h after spraying; only spraying distilled water without inoculation was taken as the blank control. The results indicated that: in comparison with the blank control, agro-antibiotic 702 treatment, Jinggangmycin treatment and single inoculation treatment all could enhance the content of MDA and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), lipoxygenase (LOX) and ascorbate peroxidase (APX) in rice leaves, the content of MDA and the activities of SOD, CAT and POD in rice plants at earlier growth stage in agro-antibiotic 702 treatment were significantly higher than those in single inoculation treatment, and the ascending rate and peak value of both APX and LOX activity in the former treatment were also higher than those in the latter treatment. The rice blast resistance induced by agro-antibiotic 702 could reach or exceed that induced by Jinggangmycin.

Agro-antibiotics 702; Rice; Rice blast; Antioxidant enzyme; Malondialdehyde

2016-12-04

国家自然科学基金项目(31360450)。

胡能(1991─),男,江西九江人,硕士研究生,从事微生物次级代谢产物研究。*通讯作者:涂国全、黄林。

S435.111.41

A

1001-8581(2017)04-0001-05