脱敏煎治疗男性免疫性不育疗效分析及对外周血T细胞亚型的影响

娄江涛　郜都　吴骏　张晓霞　魏任雄

[摘要] 目的 分析脱敏煎治疗男性免疫性不育患者前后AsAb、精液常规参数、外周血T细胞及Th细胞亚型分布的变化情况，探讨脱敏煎对男性免疫性不育患者的精液常规参数及机体免疫狀态的影响。 方法 收集男性免疫性不育患者50例，在脱敏煎治疗前后检测患者AsAb；计算机辅助精子分析仪检测精子浓度及前向运动精子（PR）；低盐膨胀实验检测精子存活率，Diff-Quick染色法检测正常精子形态百分率；流式细胞术检测患者外周血T细胞亚型分布；RT-PCR检测IFN-γ、IL-4 mRNA表达情况。 结果 经脱敏煎治疗后，患者AsAb转阴率达76.00%，精子浓度明显升高（P<0.05），精子活率及PR亦明显升高（P均<0.01），而正常精子形态百分率无明显变化（P>0.05）。患者外周血CD3+T和CD8+T细胞数明显降低，CD4+T细胞数明显升高（P均<0.01）。IFN-γ mRNA表达量显著下调（P<0.05），IL-4 mRNA的表达量显著上调（P<0.05）。 结论 脱敏煎治疗可明显改善男性免疫性不育患者T淋巴细胞功能失调，提高精子浓度/精子存活率和活力，降低AsAb阳性率。

[关键词] 男性免疫性不育；T细胞亚型；Th细胞极化；脱敏煎

[中图分类号] R246 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）03-0015-03

Efficacy of desensitization decoction in the treatment of male immunological infertility and its effect on peripheral blood T cell subtypes

LOU Jiangtao GAO Du WU Jun ZHANG Xiaoxia WEI Renxiong

Andrology laboratory， Ningbo Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To investigate the changes of AsAb， semen routine parameters， peripheral blood T cells and Th cell subtypes in patients with male immunological infertility before and after treatment， and to explore the effects of desensitization decoction on semen routine and

the immune status in patients with male immunized infertility. Methods A total of 50 patients with male immunological infertility were collected and AsAb of them were detected before and after desensitization. The sperm concentration and the forward spermatozoa （PR） were measured by computer -assisted sperm analyzer. The survival rate of sperm was detected by low salt swelling experiment. Diff-Quick staining was used to detect the percentage of normal spermatozoa. Flow cytometry was used to detect the distribution of T cell subtypes in peripheral blood of patients. And the expressions of IFN-γ and IL-4 mRNA were detected by RT-PCR. Results After treatment with desensitization decoction， the AsAb negative rate was 76.00% and the sperm concentration increased significantly（P<0.05）. The sperm viability rate and PR also increased significantly（P<0.01）， while the percentage of normal spermatozoa had no significant change（P>0.05）. The number of CD3+T and CD8+T cells in peripheral blood significantly decreased and the number of CD4+T cells increased significantly （P<0.01）. IFN-γ mRNA expression was significantly down-regulated （P<0.05）， and the expression of IL-4 mRNA was significantly up-regulated（P<0.05）. Conclusion Desensitization decoction therapy can significantly improve the T lymphocyte dysfunction in male immunized infertility patients， and improve sperm concentration， sperm survival rate and viability， and can decrease the positive rate of AsAb.

[Key words] Male immunological infertility； T cell subtype； Th cell polarization； Desensitization decoction

免疫性因素是造成男性不育的重要原因之一，前期研究發现[1]，作为器官特异性自身免疫性疾病，男性免疫性不育患者免疫系统出现T淋巴细胞功能失调及Th（helper T cell）细胞分化向Th1（helper T cell 1）细胞方向极化。多项研究表明，Th1/Th2分化失衡与多种疾病关系密切[2-5]。我院男科在运用脱敏煎治疗免疫性不育方面效果明显，可明显提高抗精子抗体的转阴率，改善男性免疫性不育患者的精液质量，但有关脱敏煎能否改善T淋巴细胞功能失调尚不清楚。因此，本文对脱敏煎治疗免疫性不育患者前后抗精子抗体（anti-sperm antibody，AsAb）、精液常规参数的变化进行报道，并分析治疗前后患者外周血T细胞分化情况及Th1和Th2细胞的效应细胞因子IFN-γ和IL-4在基因转录水平的表达情况，初步探索脱敏煎对男性免疫性不育患者的治疗效果以及对其免疫状态的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2014年9月～2016年3月我院男科就诊的免疫性不育患者50例，年龄24～46岁，平均（32.5±6.3）岁，所有患者均为初诊，排除基础性疾病及泌尿系统感染，未采取任何避孕措施且夫妻性生活正常1年以上女方未怀孕，同时排除女方不孕因素。所有患者治疗前免疫珠试验（immunobead test，IBT）结果有不少于50%活动精子表面被覆抗体，方法参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）[6]。

1.2 治疗方法

入选病例治疗以补肾益气、活血化瘀、清热利湿为治法，方用我院脱敏煎经验方，药用：百合10 g、炒黄芩10 g、丹参20 g、女贞子20 g、丹皮15 g、防风10 g、徐长卿15 g。日1剂，水煎服，早晚各1次，3个月为1个疗程，疗程结束后复查精液常规和AsAb，IgA或IgG抗体黏附的精子数≥10%为AsAb阳性，转阴者停药，未转阴者继续服药1个疗程并复查精液常规和抗精子抗体，所有对象均签署知情同意书。

1.3 主要试剂与仪器

WLJY-9000伟力彩色精子检测系统（北京伟力公司），Diff-Quick染液购自珠海贝索生物技术有限公司，普通PCR仪（德国Roche公司），荧光定量PCR仪Mx3000P型（美国Stratagene公司），总RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒均购自日本TaKaRa公司，RT-PCR试剂盒购自上海Fermentas公司，荧光抗体CD3-PE-CY5、CD4-FITC、CD8-PE均购自Beckman公司，IBT试剂由深圳华康生物医学工程有限公司提供。

1.4 标本采集

所有受试者在脱敏煎治疗前后均采用EDTA抗凝管空腹采集外周静脉血4 mL，其中0.5 mL用于FCM检测，余采用Ficoll密度梯度离心法收集外周血单个核细胞并提取总RNA。禁欲3～7 d后，手淫法采集精液，并置37℃恒温箱，待其充分液化后行精液常规检查及IBT实验。

1.5 AsAb检测

检测方法采用IBT法，实验步骤参照试剂说明书，IgA或IgG抗体粘附的精子数≥10%为有临床意义。

1.6 精液分析

精液分析依照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）要求进行。

1.7 T淋巴细胞亚群检测

将5 μL三色荧光抗体CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE加入0.5 mL EDTA抗凝外周静脉血中，混匀后室温避光孵育15 min，溶血仪中破坏红细胞后PBS缓冲液洗涤离心后弃上清，再用500 μL PBS重悬后采用流式细胞仪检测分析。

1.8 RT-PCR检测IFN-γ和IL-4 mRNA

（1）采用Trozol法提取外周血单个核细胞RNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，提取RNA经DU800紫外分光光度计测定A260/A280比值在1.8～2.0之间用于后续试验。（2）cDNA合成：总反应体系20 μL，含11 μL RNA模板样品和 1 μL 0.5 μg/μL的Oligo（dT）18，具体操作按照试剂盒说明书进行。（3）mRNA扩增：操作按照试剂盒说明书进行，PCR反应体系20 μL（引物1 μL，cDNA 2 μL，Universal Master Mix 10 μL，H2O 7 μL）。反应条件为94℃ 2 min，95℃ 10 s，600C 30 s，40个循环。根据Genebank所收录的mRNA序列利用软件Premier 5.0设计特异性引物，IFN-γ mRNA上游引物5-TTTTGGGTTCTCTTGGCTGTT-3，下游引物5-CTCCTTTTTCGCTTCCCTGT-3。IL-4 mRNA上游引物5-AATTGCCTCACATTGTCACT-3，下游引物5-CTCTCATGATCGTCTTTAGCC-3。内参基因β-actin：上游引物5-GGCACCCAGCACAATGAAG-3，下游引物5-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3。

1.9 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后免疫性不育患者精液质量和抗精子抗体检测结果比较

脱敏煎治疗后免疫性不育患者精子浓度、精子存活率和PR明显升高，而正常精子形态百分率无明显变化，AsAb转阴率为76.00%，见表1。

2.2治疗前后免疫性不育患者T细胞亚群分析比较

见表2，脱敏煎治疗后患者CD3+T与CD8+T细胞数显著降低（P<0.05），CD4+T细胞数显著升高（P<0.05），CD4+/CD8+比值上升。

2.3 治疗前后免疫性不育患者IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表达情况比较

检测结果显示，与治疗前相比脱敏煎治疗后患者IFN-γ mRNA表达量显著下调（P<0.05），相反，IL-4 mRNA的表达量显著上调（P<0.05），见表3。

3讨论

免疫因素是造成男性不育症的重要原因之一，其原因为血睾屏障因某些因素被破坏后使得自身的免疫系统对精液中的抗原产生免疫反应，导致抗精子抗体产生[7-8]。研究表明，多种自身免疫性疾病均存在T淋巴细胞功能紊乱，同时多种细胞因子在男性生殖系统中发挥重要作用[9]。T淋巴细胞主要分为CD8+T和CD4+T细胞，CD8+T细胞又称杀伤性T细胞，主要功能为特异性直接杀伤靶细胞，CD4+T细胞又称辅助性T细胞，其中Th1细胞主要分泌IL-2、IL-12、IL-15、TNF-α 和IFN-γ等，功能为增强吞噬细胞功能，介导细胞免疫应答，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等，功能为促进B细胞的增殖、分化和抗体生成[10]。而本研究所选AsAb阳性的免疫性不育患者却出现了促进细胞免疫功能的CD8+T及Th1细胞升高，提示免疫性不育患者免疫功能紊乱，主要为细胞免疫介导引起的如血睾屏障破坏，而B细胞介导的体液免疫及AsAb的产生可能为被动从属关系，通过中药脱敏煎治疗后可明显降低CD8+T、Th1细胞及IFN-γ mRNA，进而改善细胞免疫功能。

传统医学没有免疫性不育这一病名，依据临床表现，将其归于中医学 “不育”、“无子”范畴。目前中医学虽对本病的病因机制尚无统一的认识，但通过其临床表现及长期临床实践的体会，我们认为其基本病机不外虚实两端，且为虚实夹杂。虚者责之于肾气亏虚，实者责之于肝经湿热，故肾虚肝实、虚实夹杂是其基本病机。《内经》载“男子七八精少，八八天葵绝而无子”，《千金方·求子论》中云：“凡人无子当为夫妻惧有五劳七伤、虚赢百病所致，故有绝嗣之患”。肾主生殖，因此不育症多从肾論治。若先天禀赋不足，肾气亏虚，生殖之精不足，可导致不育。或因外邪结聚日久，伤及肾气，造成肾气亏虚，正虚邪实，不能主持生殖，从而导致不育。肝主疏泄，与生殖关系密切。如肝疏泄不及，气血不畅，瘀血、湿热等有形之邪羁于下焦，阻滞精室精道，日久损正，以致灭活精子，发为免疫性不育。因此，肾肝同病，虚实夹杂，是免疫性不育的基本病机，而气血失和、湿瘀互结则被认为是免疫性不育的辩证要点。脱敏煎正是我们基于以上认识治疗免疫性不育的经验方。方中百合、女贞子补肾益气，可显著提高精浆免疫抑制物活性，减轻免疫反应。女贞子可通过增强细胞表面受体活性而促进T细胞活动[11-12]。丹参、丹皮具有活血化瘀、通精祛邪等功效，其能调节机体微循环，使体内抗原抗体复合物加速代谢。丹参能通过双向调节细胞因子的分泌而影响机体有免疫调功能，可抑制抗体形成，并对已沉积的抗原抗体复合物有促进吸收和消除的作用[13-16]。黄芩、徐长卿具有清热利湿药、抗菌消炎等作用，并能对异常的免疫反应起抑制作用[17-19]。防风祛风，乃风能胜湿之意，且为风药之润剂，无伤正之弊，现代药理学研究认为防风有提高机体免疫机抑制变态反应的作用[20]，全方共奏清热利湿、活血祛瘀、补肾益气之功，通过改善细胞及体液免疫功能，消除导致AsAb产生的因素，进而有效治疗男性免疫性不育。

目前男性免疫性不育的发病机制仍然不完全透彻，而在该病的治疗方面中医治疗的疗效较西医优势明显，本研究发现脱敏煎对男性免疫性不育疗效明显，能明显降低精浆AsAb，改善患者外周血中T细胞及其亚群失衡，但相关药理及免役学机制仍须进一步研究。

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（收稿日期：2016-11-07）