lncRNA在器官纤维化疾病中的研究进展

丁海麦，李彩艳，张学明*

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014000；2.包头医学院药学院，内蒙古包头 014000)

文献综述

lncRNA在器官纤维化疾病中的研究进展

丁海麦1，李彩艳2，张学明1*

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014000；2.包头医学院药学院，内蒙古包头 014000)

器官纤维化是多种因素引起的器官急性或慢性的病理变化，严重影响人类健康。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200核苷酸非蛋白编码RNA，越来越多证据表明可通过染色质修饰、转录水平、转录后水平等多种调控途径参与多种疾病的发生发展。lncRNA参与调控纤维化多种生物学过程，有望成为器官纤维化诊断和预后分子标志物及药物作用新靶点。论文就lncRNA来源、作用机制及在器官纤维化中的最新研究进展做一综述，以期为器官纤维化的临床诊断和以lncRNA 为靶点开发药物治疗器官纤维提供参考。

长链非编码RNA；纤维化；心脏；肝脏；肺

长链非编码RNA(lncRNA)是一种RNA聚合酶Ⅱ转录生成的类似mRNA的新型转录物，长度大于200 bp 个核苷酸非蛋白编码RNA。lncRNA在表观遗传、转录和转录后水平调节基因表达，在各种生物过程中起关键作用，包括印记控制、细胞分化、发育、免疫应答、细胞周期和凋亡[1-3]。lncRNA在癌症、老年痴呆症、糖尿病、心脏衰竭等疾病发挥重要作用。脏器纤维化是多种因素引起的脏器急性或慢性的病理变化，若不能得到有效控制，最终可能发展为脏器衰竭，严重影响人类健康。近年来，lncRNA参与脏器纤维化的发生、发展过程日益成为研究热点，以lncRNA靶点为临床靶向治疗脏器纤维化提供了可能性。

1 lncRNA的来源

Ponting C P等[4]认为lncRNA可能通过以下5 种方式生成：①生物进化过程中蛋白质编码基因发生阅读框的插入，插入的阅读框和之前的编码序列形成新的功能性lncRNA，Xist基因编码一种与哺乳动物X染色体失相关的lncRNA，而Xist基因启动子区域和4 个外显子与蛋白质编码基因Lnx3 基因的部分同源。②两个不转录的并且之前相隔十分遥远的序列区域经染色体重排，合并形成一种多外显子的lncRNA，如犬科动物一个lncRNA就是经历了此种序列谱系演变(ESTs 为BM537447、C0597044和DN744681)。③非编码基因通过反转录转座复制，产生有功能的非编码逆基因或非功能性的非编码反转座假基因，如小鼠睾丸衍生的lncRNA AKOl96l6和Neat2。④ lncRNA内部出现邻近的序列串联重复，几个重复序列串联形成新的lncRNA，如真兽亚纲动物中印记基因簇中的Kcnq1ot1 的5′区域和Xist部分序列的形成。⑤转座元件序列插入产生有功能的lncRNA，存在于啮齿动物大脑细胞质中的lncRNABC1和类人猿大脑细胞质中的lncRNABC200形成与转座元件插入有关。

2 lncRNA的作用机制

lncRNA的功能不仅涉及染色体动力学、端粒生物学和细胞亚结构组建，同时也参与调节蛋白质编码基因表达。与miRNA不同的是，lncRNA没有一种普遍的作用模式，它以许多不同的方式来调控基因表达和蛋白合成。lncRNA参与基因调控的基本过程，包括染色质修饰、转录和转录后加水平。

2.1 染色质修饰

lncRNA通过招募染色质重塑复合物到基因特定位点介导表观遗传变化。如人类的同源盒(HOX)位点数百个lncRNA沿时空发展轴依次表达，引起的染色质结构域组蛋白甲基化和RNA聚合酶结合程度差异化，lncRNA Hox转录反义RNA(HOTAIR)，起源于HOXC基因座，募集多梳蛋白复合PRC2，诱导染色质变成紧密状态，沉默HOXD基因座 40 kb区域转录[5]。lncRNA构建染色质修饰复合物，能帮助我们理解表观遗传现象，如印迹。X染色体失活是由lncRNA Xist介导，Xist基因非编码转录小产物、RepA招募PRC2沉默X 染色体，反义转录Tsix恢复X染色体活性[6]。同时一个XIST和Tsix 退火形成了一个RNA双链，在Dicer作用下加工成被小干扰RNA(siRNA)，抑制失活的X染色质的修饰[7]，长链和小RNAs同时参与X染色体重塑，提示RNA调控存在着一个更为复杂的、交互的网络。

2.2 转录水平调节

增强子和启动子的普遍转录预测lncRNA在调节转录过程中发挥核心作用，lncRNA调控转录手段包含多种机制。①近端启动子转录的lncRNA可招募和整合功能RNA结合蛋白调控转录，如DNA损伤信号诱导细胞周期蛋白D1基因启动子相关lncRNA表达，lncRNA通过激活RNA结合蛋白TLS抑制CREB结合蛋白与p300组蛋白乙酰转移酶活性，抑制细胞周期蛋白D1表达[8]。②lncRNA作为辅因子调节转录因子活性，如老鼠中lncRNA Evf2 由从超远增强子转录生成，通过招募和作用转录因子D1X2，诱导增强子自身调节蛋白质编码基因表达[9]。③lncRNA通过转录起始复合物形成和选择启动子方式调节RNA聚合酶(RNAP)Ⅱ活性，如人类二氢叶酸还原酶基因(DHFR)上游转录生成的lncRNA结合到DHFR的核心启动子区域形成三链复合物，阻止转录因子TFIID结合启动子，真核生物染色体中存在大量三链结构可能是lncRNA转录起始的普遍机制。④RNA聚合酶Ⅲ转录生成的lncRNA可以与RNAPⅡ相互作用调节转录，这类lncRNA通常衰减依赖RNA聚合酶Ⅱ的基因表达。如热冲击诱导转录生成的lncRNA Alu(包含结合聚合酶和抑制转录起始复合生成物两个区域)，Alu紧紧结合RNAPⅡ阻止开放转录起始复合物的生成[10]。

2.3 转录后水平调控

lncRNA通过识别互补序列、高度特异相互作用，调节各种转录后过程包括剪接、编辑，运输、翻译与降解。多数哺乳动物基因表达反义转录物，构成一类lncRNA动态调节mRNA，反义lncRNA与mRNA形成RNA双链掩盖了mRNA关键顺式元件，通过可变剪接调节mRNA转录后加工，例如Zeb2(称为Sip1)反义RNA互补结合Zeb2 mRNA 5'UTR端内含子的5'剪接位点，该内含子有ZEB2高效翻译与表达蛋白核糖体进入位点，lncRNA互补结合则抑制该内含子的剪接，从而导致Zeb2高效表达[11]。lncRNA还可通过退火形成双链RNA引导蛋白质效应复合物靶向降解mRNA，机制类似与siRNA引导RNA诱导沉默复合物(RISC)靶向降解mRNA，互补lncRNA退火或lncRNA内部发夹产生双链RNA，都可以加工成生类似siRNA沉默基因表达。最近发现 lncRNA NRON能调节转录因子nfat 从包浆向细胞核转运，同时观察到许多lncRNA定位于细胞质，表明lncRNA细胞生物学中有大量未被发现的角色。

3 lncRNA与脏器纤维化

脏器纤维化是多种因素引起的脏器急性或慢性的病理变化，若不能得到有效控制，最终可能发展为脏器衰竭，严重影响人类健康。lncRNA已被证实在其在器官纤维化发生、发展过程中发挥重要作用，具有重要的现实意义。

3.1 lncRNA与心脏纤维化

髓样分化的初级反应基因(MyD88)为心脏病变相关基因，MyD88与缺血再灌注诱导的心肌梗死相关，基因敲除MyD88能够减少心肌梗死面积，mir-489通过靶向 MyD88影响心肌梗死[12]。为了探索lncRNA能否通过调控mir-489影响心肌梗死，wang K[13]等用实时定量RT-PCR检测血管紧张素Ⅱ处理大鼠的lncRNA表达水平，发现lncRNA(ak048451)命名为CHRF，在小鼠心脏、心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞表达水平大幅升高，小鼠模型心脏主动脉缩窄和人类的心脏衰竭组织中CHRF表达水平也大幅升高。生物信息学预测CHRF与mir-489存在结合位点，进一步证实过量表达CHRF细胞中mir-489表达水和活性平都降低。CHRF作为mir-489海绵体降低mir-489水平，提升MyD88来参与心脏纤维化进程。机体lncRNAs表达失调参与心脏纤维化及相关的病理过程。Qu X F[14]等研究lncRNA参与心肌梗死(MI)诱导的心脏纤维化发生，基因芯片分析4周后心肌梗死周围区和假手术对照小鼠的左心室组织lncRNA、mRNA差异表达水平，检出的55 000个lncRNA中MI组织有263个表达显著上调，282个表达显著下调，检出的23 000个mRNA中MI组织142个表达显著上调，67个表达显著下调。在差异表达的lncRNA中，53个上调了≥2.0倍的变化，37个下调了0.5倍的变化，随机选择9个上调和5个下调的lncRNA进行实时定量PCR(qRT-PCR)验证,分析得出心脏纤维化发生相关的57个差异表达的lncRNA和20个差异表达mRNA之间有173个相关的lncRNA-mRNA结合位点。进一步证实lncRNA NONMMUT022554与6个心脏纤维化发生相关基因表达上调正相关，这6种蛋白质为细胞外基质(ECM)-受体相互作用和磷酸肌醇三磷酸激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路中间分子。纤维化信号通路与lncRNA相互作用共同调节器官纤维化进程，TGF-β信号通路和MAPK信号通路是纤维化发生、发展的关键信号通路，在大鼠心梗纤维化组织中两个信号通路重要信号分子TGF-β3受多个lncRNA调节[15]。PTEN/MMP-2信号通调控细胞增殖和生长的通路之一，心肌细胞中lncRNA GAS5 与miR-21相互作用调节PTEN的表达，影响脏成纤维细胞的增殖[16]。

3.2 lncRNA与肝脏纤维化

TGF-β激活的lncRNA-ATB，是TGF-β信号通路关键调节因子，与肝硬化发生和肝细胞癌(HCC)血管侵袭呈正相关。Fu N等[17]确认了丙型肝炎病毒(HCV)相关肝纤维化患者肝组织和血浆样本中的lncRNA-ATB高表达水平，同时血浆lncRNA ATB水平与肝纤维化分期显著正相关。在活化肝星状细胞(HSC)中lncRNA-ATB的表达水平升高，敲除lncRNA-ATB抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和α-1型Ⅰ型胶原(Col1A1 )生成，进一步研究发现lncRNA-ATB、TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)和SMAD2共享miR-425-5p的miRNA响应元件。HSC中lncRNA-ATB的过度表达通过抑制内源性miR-425-5p上调TGF-βRII和SMAD2表达，说明lncRNA-ATB通过争性结合miR-425-5p激活活化HSC，增加胶原Ⅰ产生来促进HCV诱导的肝纤维发生。Na F等[18]为了阐明 lncRNA-ATB/miR-200α /β-连环蛋白调节轴在HSC活化和肝纤维化发展中作用。通过活检或手术从18名患有严重肝纤维化的HCV患者和6名健康受试者(对照)获得肝组织。双重荧光素酶报告基因验证lncRNA-ATB/miR-200α和β-连环蛋白之间的结合位点，检测HSC中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和1型胶原(Col1A1)的表达评估lncRNA-ATB/miR-200α /β-连环蛋白对HSC活化的影响。双荧光素酶报告证实，lncRNA-ATB含有结合miR-200α和β-连环蛋白的共同作用位点，在HCV相关肝纤维化患者的肝组织和激活的HSC中观察到miR-200α的表达降低，β-连环蛋白的表达增加。敲除lncRNA-ATB可以通过上调内源性miR-200α抑制LX-2细胞的活化下调β-连环蛋白表达，得出lncRNA-ATB/miR-200α /β-连环蛋白调节轴与HCV患者肝纤维化的发展相关，敲除lncRNA ATB可能是治疗HCV相关的肝纤维化的新靶点。甲基CpG结合蛋白2(MECP2)是肝纤维化的关键因素，lncRNA H19调节细胞增殖重要的表观遗传因子，Yang J J 等[19]CCl4腹腔注射 SD大鼠制备肝纤维化模型 ，取HSC-T6细胞用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组化分析MeCP2、H19、胰岛素样生长因子Ⅰ受体(1GF1R)、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)表达水平 ，结果显示在HSC和纤维化组织中H19表达水平显著降低，而 MeCP2 和IGF1R表达水平升高。进一步试验表明激活的HSC中敲除MeCP2提升H19表达水平，反之过表达MeCP2抑制H19表达；H19在激活HSC过度表达抑制的IGF1R的表达，H19沉默则观察到相反结果。得出MeCP2沉默通过lncRNA H19提升IGF1R的表达，促进肝星状细胞的增殖。纤维化信号分子TGF-β可调节纤维化器官lncRNA 特异的表达，部分lncRNA与编码细胞外基质相关基因形成基因调控网络，参与纤维化过程。纤维化过程中TGF-β诱导肝星状细胞特异表达400多lncRNA，这些lncRNA与胶原蛋白基因、细胞外基质调节蛋白紧密相互作用，在形成纤维化瘢痕期间调节细胞外基质[20]。

3.3 lncRNA与肺纤维化

目前对lncRNA与肺部疾病关系几可乎集中在肺癌的研究，lncRNA在肺纤维化疾病中的作用研究较少[21]。 在试验大鼠肝纤维化的肺部发现了大量表达改变的lncRNA，表明lncRNA参与肺纤维化发病机制，在这些lncRNA 包括如H19、RMRP、TERC、CHRF等[22]。特发性肺纤维化(IPF)是一种以成纤维异常积累和细胞外基质沉积为特征慢性致死性肺疾病，肺泡上皮细胞间质转化(EMT)是诱发IPF关键因素。Sun H等[23]腹腔注射百草枯建立了肺损伤和进行性间质纤维化小鼠模型。利用转录组测序和微阵列，分析百草枯诱导肺纤维化组织的lncRNA表达，确认了513个lncRNA表达上调和204个lncRNA表达下调。基因本体论分析表明差异表达的lncRNA参与细胞分化、上皮的形态发生、伤口愈合及与EMT密切相关的通路。进一步通过EMT标记基因和蛋白的表达变化确认在肺上皮细胞过度表达lncRNA uc.77或2700086a05rik诱导EMT。Huang C Q等[24]为研究lncRNA在IPF的作用，前期研究发现IPF中miR-21、miR-31、miR-101、 miR-29、mir-199 和let-7D表达失调基础上，利用包含人33829条lncRNAs非编码数据库NONCODE预测lncRNA和表达失调microRNAs的相互作用位点，鉴定出34条lncRNAs 与失调miRNA存在结合位点。通过实时定量PCR分析鉴定出的lncRNA在IPF患者的肺部表达水平，在IPF的肺部34条lncRNA中9条表达失调，其中4条与其相互作用microRNA表达呈负相关。进一步研究表明，沉默lncRNA cd99p1抑制肺成纤维细胞的增殖和α平滑肌肌动蛋白表达，而敲除lncRNA n341773增加肺成纤维细胞胶原表达。Song X D等[25]研究博来霉素诱导的肺纤维化lncRNA差异表达的lncRNA mrak088388是否作为miRNA天然诱饵，使用TargetScan和miRanda数据库查询获得的miRNA，即miR-200、miR-429、miR-29和miR-30能靶向结合n4bp2和mrak088388位点。实时荧光定量PCR结果表明miR-29和mrak088388表达在肺组织高度负相关，基于MRAK088388表达的变化与纤维化肺组织中N4bp2相似，而且很高的序列相似性，初步认定在肺肌成纤维细胞的生长和随后的胶原沉积过程中mrak088388可能通过海绵miR-29，作为竞争性內源RNA调节n4bp2表达。

4 展望

lncRNA可在多个水平调控基因表达，在脏器纤维化发生发展中具有重要作用。lncRNA在多个器官纤维化中存在特异性表达，有望成为新诊断标志物。同时，lncRNA的研究还处于起步阶段，目前主要在利用基因芯片技术、生物信息挖掘涉及生物学调控的lncRNA和lncRNA的功能方面研究，由于lncRNA来源广、功能多，可能对多种信号通路产生影响，在机制研究上尚存在一定的困难，但相信随着研究的不断深入，以lncRNA为靶点开发药物和标志物在器官纤维化诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。

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2017-05-08

内蒙古自然科学基金项目(2016MS(LH)0306)

丁海麦(1975-)，男，山西永济人，副教授，主要从事代谢生物学研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0095-05