禽白血病病毒感染对新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影响

张桂枝，靳双星*，黄炎坤，陈文萍

(1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450046;2.舞阳县动物疫病预防控制中心，河南漯河 462400)

兽医临床

禽白血病病毒感染对新城疫和禽流感疫苗免疫效果的影响

张桂枝1，靳双星1*，黄炎坤1，陈文萍2

(1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450046;2.舞阳县动物疫病预防控制中心，河南漯河 462400)

为研究禽白血病病毒(ALV)感染对新城疫(ND)和禽流感(AI)疫苗免疫效果的影响，采用ELISA方法对河南省某地方品种鸡场进行ALV-p27抗原检测，同时采集试验鸡的血清样品，检测ND、AI(H9)和AI(H5)亚型的免疫抗体水平，并比较了ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡和后期感染对ND、AI疫苗免疫效果影响的差异。结果表明，ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡，能显著降低ND、AI(H9)和AI(H5)疫苗免疫的抗体水平，阳性试验组与阴性组相比血清中ND、H9、H5(Re-6)、H5(Re-7)和H5(Re-8)抗体效价分别降低1.71 log2、2.37 log2、1.59 log2、1.00 log2和1.79 log2；鸡群后期感染ALV，对ND和AI疫苗的免疫没有明显的抑制作用，阳性试验组与阴性组相比无显著差异。

禽白血病病毒；新城疫疫苗；禽流感疫苗；免疫效果

禽白血病病毒(Avianleukemia virus，ALV)属反转录病毒，是在鸡群中普遍存在并常诱发肿瘤的三大类病毒之一[1]，几乎波及所有的商品鸡群[2-4]。有关研究表明，鸡群感染ALV除引起肿瘤导致直接发病死亡外；还严重影响鸡的生产性能，推迟性成熟、产蛋高峰维持时间缩短、产蛋率降低、受精率降低，尤其是祖代和父母代鸡群暴发禽白血病后，ALV经过垂直感染可严重影响种蛋孵化率和雏鸡的质量；另外，ALV还可导致 B淋巴细胞成熟受抑制，阻断T淋巴细胞的发育，导致胸腺和法氏囊不同程度的萎缩，使感染鸡产生免疫抑制，造成机体抵抗力明显下降，增加其他疾病继发感染的几率。迄今为止，有关ALV感染对疫苗免疫效果的影响报道较少，尤其是ALV通过种蛋垂直传播感染和后期水平传播感染对疫苗免疫效果影响的差异未见报道。本课题组根据对河南省地方品种鸡ALV感染情况调查结果，选择某鸡场开展了禽白血病的净化工作，在净化试验中重点考察了ALV感染对新城疫和禽流感两大重要疫病疫苗免疫效果的影响，并比较了ALV垂直传播感染1日龄雏鸡和后期水平传播感染对疫苗免疫效果影响的差异，为禽白血病的净化及新城疫和禽流感的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器和试剂 酶标仪为Thermo公司产品；微量加样器、96孔微量反应板、离心机、微量振荡器、ALV- p27抗原检测试剂盒均为BioChek公司产品；鸡新城疫、禽流感H5和H9血凝抑制试验检测抗原和阳性血清为中国兽医药品监察所产品。

1.1.2 试验鸡及免疫状况 试验鸡来源于河南省某地方品种鸡场，按照本场免疫程序分别进行了鸡马立克病疫苗、新支H120二联冻干苗、法氏囊冻干苗、新支流三联油苗、禽流感H5N1(Re-6+Re-7+Re-8)油苗、新支H52二联冻干苗和新支流减四联油苗等的免疫接种。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

1.2.1.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测 采样前在样品管中加入1 mL样品稀释液，用无菌棉签采集试验鸡泄殖腔棉拭子，与稀释液混匀后冷冻。反复冻融2次，检测前将样品恢复至25℃，按照BioChek公司ELISA试剂盒的操作说明进行检测。

1.2.1.2 新城疫和禽流感抗体水平测定 采用微量血凝(HA)试验，在96孔微量凝集反应板中，测定抗原的凝集滴度，然后配制4单位抗原；采用微量血凝抑制(HI)试验，测定血清样品中新城疫、禽流感H9、禽流感H5抗体效价，用n log2来表示。

1.2.1.3 经种蛋垂直传播1日龄雏鸡感染ALV对疫苗免疫效果的检测 出雏当天收集1日龄雏鸡胎粪进行ALV-p27抗原检测。选取抗原阳性鸡50只，单独隔离饲养作为试验组；选取抗原阴性鸡50只作为阴性组。2组鸡的饲养管理和免疫程序完全一致，分别在45日龄和65日龄2个时间点，每组各随机采集24只鸡的血清，检测新城疫(45日龄)、禽流感H9抗体效价(45日龄)和禽流感H5抗体效价(65日龄)，并进行统计分析比较其差异。

1.2.1.4 后期感染ALV对疫苗免疫效果的检测 选取1日龄胎粪ALV-p27抗原阴性鸡作为试验动物，8周龄时检测其ALV-p27抗原淘汰阳性鸡，阴性鸡饲养至23周龄再次检测泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原，根据检测结果将其分为两组，抗原阳性鸡为试验组(40只)，由于经过了1日龄和8周龄检测淘汰阳性鸡，因此该试验组中的鸡大部分是后期感染ALV所致；23周龄抗原阴性鸡作为阴性组(40只)。2组鸡的饲养管理和免疫程序完全一致，在 180日龄每组各随机采集24只鸡的血清，检测新城疫、禽流感H5、禽流感H9抗体效价，并进行统计分析比较其差异。

1.2.2 试验数据统计分析 试验所得的所有数据，

采用 Microsoft Excel 软件进行整理和统计分析，抗体效价数据以平均数±标准差来表示。

2 结果

2.1 经种蛋垂直传播1日龄雏鸡感染ALV对ND和AI疫苗免疫效果的影响

2.1.1 对ND抗体效价的影响 雏鸡饲养至45日龄时，分别采集阳性试验组和阴性组各24只鸡的血清，利用微量HA-HI试验，测定样品中ND抗体效价。结果显示，阳性试验组ND抗体效价平均值为8.29 log2，阴性组为10.00 log2，阳性试验组的抗体水平显著低于阴性组(P<0.05)(表1)。

2.1.2 对禽流感H9抗体效价的影响 检测结果显示，阳性试验组禽流感H9抗体效价平均值为7.13 log2，阴性组为9.50 log2，阳性试验组的抗体水平显著低于阴性组(P<0.05)(表1)。

2.1.3 对禽流感H5抗体效价的影响 雏鸡饲养至65日龄时，分别采集阳性试验组和阴性组各24只鸡的血清，利用微量HA-HI试验，测定样品中禽流感H5(Re-6)、H5(Re-7)和H5(Re-8) 抗体效价。结果显示，阳性试验组禽流感H5(Re-6)抗体效价平均值为8.58 log2，阴性组为10.17log2，阳性组显著低于阴性组(P<0.05)；阳性试验组禽流感H5(Re-7)抗体效价平均值为5.71 log2，阴性组为6.71 log2，两组间差异极显著(P<0.01)；阳性试验组禽流感H5(Re-8)抗体效价平均值为8.17 log2，阴性组为9.96 log2，两组间差异极显著(P<0.01)(表2)。

表1 45日龄鸡血清中ND、AI-H9抗体水平(n log2)

注：*表示差异显著(P<0.05)。

Note:*Mean significant difference(P<0.05).

表2 65日龄鸡血清中AI-H5抗体水平(n log2)

注：*表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:*Mean significant difference(P<0.05);**Mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 后期感染ALV对ND和AI疫苗免疫效果的影响

2.2.1 对ND抗体效价的影响 180日龄时，分别采集阳性试验组和阴性组各24只鸡的血清，测定样品中ND 抗体效价，结果显示，阳性试验组ND抗体效价平均值为10.63 log2，阴性组平均值为10.88 log2，阳性组略低于阴性组，但两组间差异不显著(P>0.05)(表3)。

2.2.2 对禽流感H9抗体效价的影响 检测结果显示，阳性试验组禽流感H9抗体效价平均值为10.00 log2，阴性组平均值为10.25 log2，阳性组略低于阴性组，但两组间差异不显著(P>0.05)(表3)。

2.2.3 对禽流感H5抗体效价的影响 检测结果显示，阳性试验组禽流感H5(Re-6)抗体效价平均值为8.33 log2，阴性组为8.29 log2，阳性组略高于阴性组，但两组间差异不显著(P>0.05)。阳性试验组禽流感H5(Re-7)抗体效价平均值为7.79 log2，阴性组为8.33log2，阳性组低于阴性组，但两组间差异不显著(P>0.05)；阳性试验组禽流感H5(Re-8)抗体效价平均值为8.25 log2，阴性组为8.46 log2，阳性组略低于阴性组，两组间差异不显著(P>0.05)(表3)。

表3 180日龄鸡血清中ND与AI-H9、H5抗体水平( log2)

2.3 垂直传播感染ALV和后期感染ALV对ND和AI疫苗免疫效果影响的差异性比较

由表1、表2、表3检测结果可知，经种蛋垂直传播1日龄雏鸡感染ALV能显著降低ND、禽流感H9和H5疫苗免疫的抗体水平，阳性组血清中ND、禽流感H9和H5抗体效价显著低于阴性组，两组间差异均极显著(P<0.01)；而后期感染ALV，对ND和AI疫苗的免疫没有明显的抑制作用，阳性组血清中ND、禽流感H9和H5抗体效价与阴性组相比无显著差异(P>0.05)。

3 讨论

由于ELISA方法检测ALV-p27抗原，无法检测出所有的外源性ALV[5-6]，因此，尽管鸡群在1日龄和8周龄两个时间点检测ALV- p27抗原淘汰阳性鸡，鸡群中仍然存在少数抗原阴性带毒鸡，这部分鸡生长到一定日龄后仍可向外排毒，导致与其接触鸡群感染ALV，这是鸡群后期水平感染ALV的重要原因。根据本试验23周龄ALV- p27抗原检测结果，阳性率达4.73%。因此在开展禽白血病净化工作时，一个世代需经多次检测淘汰抗原阳性鸡并结合病毒的分离，同时要健全生物安全制度和孵化管理，经过4～5世代净化才能达到彻底根除目的。

本试验研究结果表明，ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡能显著降低感染鸡群ND和AI疫苗的免疫效果，阳性组血清中ND、禽流感H9和H5抗体效价显著低于阴性组，两组间差异均极显著(P<0.01)；而后期水平传播感染ALV，对ND和AI疫苗的免疫没有明显抑制作用，阳性组血清中ND、禽流感H9和H5抗体效价与阴性组相比无显著差异。王建新等[7]报道，1日龄肉鸡人工感染ALV-J能显著降低新城疫的抗体效价，与本试验研究结果ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡能显著抑制ND、禽流感H9和H5免疫效果相一致。司兴奎等研究报道ALV感染程度与新城疫、禽流感的免疫抗体水平具有明显的负相关性[8]。张丹俊等研究报道五华鸡群感染ALV-J对247、278和337日龄鸡血清中ND、禽流感H9和H5抗体效价没有明显影响[9]，与本试验研究结果后期水平传播感染ALV对疫苗的免疫效果没有显著影响也相符合。

研究表明ALV可以通过干扰功能性白细胞介素2(IL-2)的合成，导致B淋巴细胞成熟受抑制和阻断T淋巴细胞的发育。商营利等研究表明，ALV-J可引起鸡胸腺、法氏囊及脾脏中淋巴细胞的凋亡，凋亡现象主要在早期，随日龄的增加凋亡细胞逐渐减少[10]。这可以部分解释本试验中ALV经种蛋垂直传播感染1日龄雏鸡能显著降低ND、禽流感H9和H5疫苗免疫的抗体水平，而后期水平传播感染对ND和AI疫苗的免疫没有明显抑制作用。ALV感染越早对鸡群的危害越严重[11]，因此，做好种鸡AL净化，降低雏鸡ALV感染率是充分发挥ND、AI等疫苗免疫效果，有效预防新城疫和禽流感的重要措施之一。

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EffectofAvianLeukosisVirusInfectiononImmunizedEfficacyofNewcastleDiseaseandAvianInfluenzaVaccine

ZHANG Gui-zhi1,JIN Shuang-xing1,HUANG Yan-kun1,CHEN Wen-ping2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan,450046,China; 2.WuyangCountryAnimalDiseasePreventionandCountrolCenter，Luohe,Henan,462400,China)

To investigate the effect of Avian Leukosis virus (ALV) infection on immunized efficacy of newcastle disease (ND) and Avian Influenza (AI) vaccine,ALV-p27 antigen was detected in a Henan local strains chicken farm by ELISA method,and the antibody levels of ND,AI(H5)and AI(H9) in infected and non-infected groups were detected，and the different immune effects between 1-day-old vertical transmission and late infection were compared.The results showed that the antibody levels of ND,AI(H5)and AI(H9)were significantly reduced by vertical transmission.In the comparison between the positive test group and the negative control group,the antibody titers for ND,H9,H5(Re-6),H5(Re-7) and H5(Re-8) were decreased by 1.71 log2,2.37 log2,1.59 log2,1.00 log2 and 1.79 log2 respectively.Moreover,antibody titers for ND and AI didn’t show obviously drop in late ALV infection,and there was no significant difference between the positive test group and the negative control group.

ALV; ND vaccine; AI vaccine; immunized efficacy

2017-04-08

河南省重大科技专项计划项目(161100510200)；校科技创新团队项目(HUAHE2015003)

张桂枝(1970-)，女，河南原阳人，副教授，硕士，主要从事畜禽疫病防治的教学与科研工作。*

S813.7

B

1007-5038(2017)12-0119-04