油茶内生真菌多样性与抑菌性研究

张 婷，左雪枝，徐 艳

(荆楚理工学院 生物工程学院，湖北 荆门 448000)

油茶内生真菌多样性与抑菌性研究

张 婷，左雪枝，徐 艳

(荆楚理工学院 生物工程学院，湖北 荆门 448000)

为弄清油茶内生真菌的种类、分布特点及应用潜能，采集湖北省5个地区不同季节的油茶样品，分离其内生真菌并进行多样性分析和抑菌性分析。结果表明，共分离得到内生真菌1 612株，经形态学鉴定可归于24属，未产孢的菌株暂归为无孢菌群(66株)。青霉属(Pencillium)、链格孢属(Alternaria)、刺盘孢属(Colletotrichum)为优势类群，分别占总菌株数的21.09%、19.11%、14.70%。多样性分析结果显示，对于不同地区而言，黄冈地区油茶内生真菌的Shannon-Wiener指数(H′)最高，为2.44 ；就不同组织部位来看，茎中内生真菌的Shannon-Wiener指数(H′)最高，为2.52；就不同季节而言，秋季油茶内生真菌的Shannon-Wiener指数(H′)最高，为2.58。总体而言，油茶中内生真菌的菌群较为稳定，地区间及组织部位间样品内生真菌组成有一定的相似性。抑菌性结果显示，在挑选的24株内生真菌中，有17株内生真菌的发酵提取物具有抑菌活性，其中 3株表现出较好的抑菌效果，分别属于青霉属、链格孢属、叶点霉属(Phyllosticta)，这说明油茶内生真菌的抑菌性较强，值得进一步研究。

油茶； 内生真菌； 分离率； 多样性； 抑菌性

植物内生真菌是一种潜在的、具有广阔应用前景的微生物资源，它们普遍存在于健康植物中，用特定的方法可以证明其存在。植物内生真菌种类众多、数量巨大，在不同植物，甚至是同一植物的不同部位，亦或是处于不同生长季节的同一植物，其内部的真菌种类和数量都有差异，形成了内生真菌的多样性。深入研究内生真菌的多样性将有助于了解内生真菌的分布特点，建立内生真菌生物多样性的信息库，还有助于不断发现新物种等[1-3]。

油茶(Camelliaoleifera)是我国南方特有的木本油料树种，其主要产品茶油富含多种不饱和脂肪酸，享有“东方橄榄油”之美誉[4]。近年来，由于油茶产品市场的逐渐升温，南方多地大力发展油茶产业，纷纷建起了油茶栽培种植基地。与油茶有关的科研工作也随之开展起来，主要集中在油茶育种、油茶深加工和油茶病虫害防治等方面，而对于油茶内生真菌的研究相对较少。内生真菌作为与宿主共生的资源而存在，有助于促进宿主的生长，提高宿主的抗逆性和抗病虫害能力，也有助于提高宿主中某些次级代谢产物的产量，因此有必要弄清楚油茶内生真菌的种类、分布特点及其应用潜能。鉴于此，对湖北省5个采集地的油茶样品进行菌株分离、鉴定、统计和抑菌性初探，比较了油茶内生真菌在不同组织部位、不同季节和不同地理位置的分布差异，探讨了油茶内生真菌的分布特点，筛选了具有一定抑菌能力的菌株，并对抑菌能力较优的菌株进行了分子鉴定，为进一步开发利用油茶内生真菌资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 油茶样品 分别于2013年的春季(4月)、夏季(7月)和秋季(10月)，在湖北省十堰、荆门、恩施、黄冈、武汉5个地区定点随机采集若干健康的油茶样品，装入自封袋带回实验室,于48 h内分离内生真菌。

1.1.2 培养基 内生真菌的分离和保藏均采用PDA培养基，临用前加入一定浓度的抗生素。

1.1.3 供试病原菌 供试病原菌有7种，其中细菌2种，为大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，由荆楚理工学院微生物实验室提供；植物病原真菌有5种，分别是西瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumvf.sp.niveum)、番茄早疫菌(Alternariasolani)、葡萄炭疽菌(Glomerellacingulata)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、小麦赤霉菌(FusariumgraminearumSchw)，由鲁东大学杨润亚教授提供。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离纯化 采用组织块分离法分离内生真菌[5]。取新鲜的油茶组织材料根、茎、叶适量(其中根、茎剪成适当大小)，分别用自来水清洗干净，置于75%乙醇中浸泡1～2 min，用无菌水冲洗3～4次；再用0.2%升汞浸泡1～2 min，用无菌水冲洗3～4次[6]；然后，置于已紫外线杀菌30 min的超净工作台上晾干，用无菌刀片分别将消毒后的叶片裁成2 mm×2 mm大小、将根和茎(枝条)截成长度为2 mm的小段，接种到PDA培养基上。每次分离，每个地区每种材料均接种100个组织块。

将接种了组织块的培养皿置于28 ℃恒温培养箱中4～7 d，隔日观察组织切口部位菌丝的生长情况。待组织切口部位有菌丝长出时，用接种针挑取边缘菌丝以三点点植法接种到新的PDA平板上继续培养，纯化2～3次后得到单一菌种。

1.2.2 内生真菌的鉴定与保藏 内生真菌分类地位的确定采用形态学鉴定法，包括菌落形态和个体形态。通过平板培养观察菌落形态，如菌落大小、颜色、纹饰、质地、边缘等；通过制片观察个体形态，如菌丝的特征、孢子的形态等。根据这些形态特征依据《真菌鉴定手册》[7]鉴定到属。将已经鉴定的菌种接入PDA试管斜面培养基，4 ℃冰箱中保藏备用。

1.2.3 数据处理 统计不同地区、不同组织部位、不同季节样品分离出的各种内生真菌数量[8]，并按表1进行数据处理与分析。

1.2.4 抑菌能力测定 对待测内生真菌进行液体培养，收集发酵产物[9]。将病原菌分别活化后，制成终浓度为106cfu/mL的指示菌菌液，分别涂布于相应的培养基上。抑菌活性的测定采用滤纸片法。将无菌的、直径为5 mm的滤纸片浸泡在待测菌的发酵液中约2 h，用浸泡了甲醇溶液的无菌滤纸片作对照，在超净工作台中将浸泡好的滤纸片放入刚制作好的指示菌平板的中央，每个样品3个重复。细菌置于37 ℃、真菌置于28 ℃培养，定期观察并记录结果。

1.2.5 具有抑菌活性的部分菌株的分子鉴定 采用CTAB法提取真菌的基因组DNA，扩增反应所用引物为ITS-1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS-4(5’-TCCTCCGCTTATTGTATGC-3’)[10]。扩增、克隆后选取15个阳性克隆子的菌液送武汉伯尔生物科技有限公司进行测序。将测定序列用NCBI GenBank数据库中BLAST程序进行比对分析，再用MEGA软件进行聚类分析，探讨每个菌株的分类地位。

表1 数据处理所用指标的计算方法及用途

2 结果与分析

2.1 油茶内生真菌的组成

从湖北5个地区不同季节采集的油茶根、茎、叶样品共4 500个组织块中分离得到内生真菌1 612株，其中有66株因不产孢而未鉴定出种属，暂归为一类——无孢菌群(sterile mycelia)，其他菌株经鉴定后归于24属，分别属于5个目，即从梗孢目(Moniliales)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、黑盘孢目(Melanconiales)、盘菌目(Pezizales)、座囊菌目(Dothideales)(表2)。在目的分类水平上，从梗孢目为优势菌群，占总菌株数64.56%；在科的分类水平上，丛梗孢科为优势菌群，占总菌株数的40.62%；在属的水平上，青霉属(Pencillium)、链格孢属(Alternaria)、刺盘孢属(Colletotrichum)为优势类群，分别占总菌株数的21.09%、19.11%和14.70%。

表2 油茶内生真菌的类群组成

2.2 油茶内生真菌的差异分布

2.2.1 在不同组织部位的分布 油茶不同组织部位均有内生真菌分布，已鉴定出种属的1 546株内生真菌中以叶分离的最多，共824株；其次是茎，有490株；根最少，仅232株。这些不同组织部位样品的内生真菌菌群在数量上存在差异，叶中有21个属，茎中有22个属，根中分布17个属(表3)。此外，在叶和茎中还发现了内生真菌特有属，在叶中的特有属为壳单孢属(Amerosporium)，在茎中的特有属为鲜壳孢属(Zythia)。

表3 油茶内生真菌菌群的的差异分布及多样性指数

2.2.2 在不同地理位置的分布 油茶内生真菌菌群因采样地不同分离情况也有区别(表3)。从分离率上来看，依次为恩施(381株，分离率8.47%)、黄冈(365株，分离率8.11%)、荆门(328株，分离率7.29%)、武汉(327株，分离率7.27%)、十堰(145株，分离率3.22%)。由表4可见，除了共有的优势菌群外，各地区具有各自的优势菌群，其中，恩施为头孢霉属(Cephalosporium，2.98%)，黄冈为球座菌属(Guignardia，2.36%)，荆门为瓶梗青霉属(Paecilomyces，2.85%)，武汉为木霉属(Trithoderma，2.17%)，十堰为枝孢霉属(Cladosporium，1.36%)。此外，油茶内生真菌也具有一定的地理分布特征，恩施为鲜壳孢属，黄冈为壳单孢属。

表4 不同地区油茶内生真菌菌群的比较

2.2.3 在不同季节的分布 分离率在不同季节也不一样。由表3可见，春季分离了16属277株内生真菌，分离率为6.16%；夏季分离了21属480株内生真菌，分离率为10.67%，秋季分离了22属789株内生真菌，分离率为17.53%。

2.3 油茶内生真菌的多样性

2.3.1 菌群的多样性指数 由表3可见，5个采样地点间油茶内生真菌的多样性指数存在差异。从属的水平看，恩施采样地点的内生真菌种类最多，有20个属，黄冈和武汉次之，有18个属，十堰最少，仅10个属；从Shannon-Wiener指数(H′)来看，黄冈最高，为2.44 ，恩施次之，为2.37，十堰最低，为1.74；从Simpson指数(D)来看，黄冈为0.89，恩施为0.86，十堰为0.79，其表现趋势与Shannon-Wiener指数(H′)基本保持一致。不同组织部位油茶样品内生真菌的多样性指数也存在差异。从属的水平看，茎中内生真菌的种类最多，有22个属，叶中有21个属，根为17个属；从Shannon-Wiener指数(H′)和Simpson指数(D)来看，均体现出多样性的大小关系为茎>叶>根。由不同季节油茶样品内生真菌的Shannon-Wiener指数(H′)和Simpson指数(D)表现为秋季>夏季>春季。

均匀度可以反映群落中不同物种个体数目分配的均匀程度。通过各内生真菌种群均匀度指数(J)发现，分离得到的内生真菌种群均匀度各不相同，以黄冈地区最高(0.77)，十堰地区最低(0.55)。

2.3.2 菌群的相似性指数 由表5、6可见， 5个采样地点分离获得的内生真菌菌群的相似性指数均≥0.50，这说明各地油茶内生真菌菌群之间有一定的相似度，其中以黄冈和武汉的相似性指数最高，为0.89，十堰与其他各地的相似度均偏低。从不同组织部位油茶样品中分离的内生真菌菌群相似性指数表现为叶与茎的内生真菌相似性指数最高(0.88)，叶与根的内生真菌相似性指数最低(0.79)。

表5 不同地理位置油茶样品内生真菌菌群组成的 相似性指数(CS)

表6 不同组织部位油茶样品内生真菌菌群组成的 相似性指数(CS)

2.4 油茶内生真菌的抑菌能力

从每个属中随机挑取1株菌株进行发酵培养，共获得24组发酵液(编号分别为OUT-1、OUT-2…OUT-24)。由表7可见，总共有17株菌株的发酵液对至少1种指示菌有一定的抑菌能力，占全部内生真菌种类的70.83%。其中对西瓜枯萎菌有抑制作用的有6株；对番茄早疫菌有抑制作用的有6株；对葡萄炭疽菌有抑制作用的有4株；对番茄灰霉菌有抑制作用的有6株；对小麦赤霉菌有抑制作用的有2株；对大肠杆菌有抑制作用的有6株；对金黄色葡萄球菌有抑制作用的有3株。

在这17株具有抑菌能力的内生真菌中，仅对植物病原真菌有抑菌能力的有9株，仅对细菌有抑菌能力的有2株，既对植物病原真菌有抑菌能力又对细菌有抑菌能力的有6株；其中，OUT-1、OUT-11和OUT-15分别对4、5、4种供试菌有较强的抑制作用且抑菌效果较好，其中以OUT-11的抑菌效果最佳，它的抑菌范围较广且抑菌程度较强。

表7 油茶内生真菌的抑菌能力

2.5 3株具有抑菌活性的油茶内生真菌的聚类分析

对OUT-1、OUT-11和OUT-15 3株抑菌活性较好的内生真菌进行序列测定，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为外群，按照NJ(neighbor-joining)法所构的聚类分析图见图1。OUT-1与青霉属的菌株聚为一支，OUT-11与链格孢属菌株聚为一支，OUT-15与叶点霉属菌株聚为一支，故判断OUT-1属于青霉属(Penicillum)，OUT-11属于链格孢属(Alternaria)，OUT-15属于叶点霉属(Phyllosticta)，这与形态学鉴定的分类结果一致。

图1 抑菌活性较好的菌株的聚类分析

3 结论与讨论

随着内生真菌研究的逐步升温，越来越多的植物内生真菌被筛选、分离和鉴定。总体上看，内生真菌的研究方法通常有2种，一种是传统的组织培养分离法，另一种是免培养法。组织培养分离法是将组织块进行表面消毒后，接种于固体培养基，经反复纯化终得到纯菌株的方法，该方法耗时长，处理较为繁琐，但是可以获得数量众多的纯菌株。而免培养法则是跳过了培养阶段，在PCR扩增时既会扩增出植物的ITS序列，也会有内生真菌的ITS序列，但这2种序列大小上通常存在差异，因此，通过切胶纯化的方式可将二者分开，测序后通过序列比对获得植物内生真菌的相关信息，这种方法简便易行，但缺点是没有相应的内生真菌培养物，不利于后续研究。本试验主要采用组织培养分离法，从油茶4 500个组织块中共筛选出1 612株内生真菌，经形态学鉴定为24个属，属于子囊菌，其中青霉属、链格孢属、刺盘孢属为优势类群，这些菌属在他人研究中也存在[11-12]。Zhou等[13]采用免培养法分析了油茶叶片中内生真菌的组成。通过PCR和序列比对分析，证实扩增出的序列全部来自于子囊菌，其中曲霉属(Aspergillus)为优势菌株。 张林平等[14]同样采用传统方法从江西省林业科学院油茶园中选取了9株油茶健康植物进行内生真菌的分离。结果显示，芒果球座菌(Guignardiamangiferae)为油茶内生真菌的优势种，青霉属、链格孢属、镰孢属(Fusarium)在油茶不同组织部位也广泛出现。

除了筛选油茶中的内生真菌外，本研究还探讨了油茶内生真菌在不同组织部位、不同季节和不同地区间分布的差异。结果显示，油茶叶、茎和根中内生真菌的分离率依次降低，表明内生真菌在不同组织部位的定殖率存在差异，叶片受内生真菌侵染的概率最高，该结果与张林平等[14]和周希等[15]的研究结果基本一致；秋季、夏季和春季的分离率呈现递减趋势，这可能是由于季节不同，受气候的影响，春季气温较低，不易于孢子萌发，而夏季降雨量丰富以及秋季合适的气温，为内生真菌的生长提供了适宜的条件，所以夏、秋季节的内生真菌数量高于春季；不同地区间内生真菌的分离率显示，恩施和黄冈高于荆门和武汉，更高于十堰，可能是因为恩施和黄冈的环境条件较为相似，都是物种丰富的山区，气候宜人，湿度大，利于内生真菌的定殖和生长，而分离率最低的十堰，可能是因为采集的样品生长年限较短，基本上都是油茶苗，所以内生真菌数量偏少。由此可见，分离出的内生真菌的种类和数量在一定程度上受到取样地点、取样部位和取样时间的影响。

内生真菌的丰富度指数和均匀度指数可反映其多样性的高低和菌群是否稳定。本研究中Shannon-Wiener 多样性指数和Simpson指数结果基本一致，不同地区中以黄冈地区内生真菌的多样性指数最高；就组织部位而言，茎中内生真菌的多样性最高；就季节而言，秋季内生真菌的多样性指数最高，种类最多。其中，茎中分离出的内生真菌数量虽然少于叶片，但其种类更多一些。Evenness指数反映均匀度状况。本研究结果显示，各地区、各组织和不同季节内生真菌菌群相对比较稳定，说明油茶在长期生长过程中与其环境中的内生真菌菌群可能形成了良好的共生关系，只是因为十堰地区的样品是油茶苗，所以均匀度偏低。相似性系数结果显示，黄冈与武汉地区的油菜内生真菌相似性系数最高，而十堰与其他地区的油菜内生真菌相似性系数普遍偏低。根与茎的内生真菌相似性系数小于茎与叶的内生真菌相似性系数，这可能反映出内生真菌的一种侵染机制，还有待于进一步的研究。

24株内生真菌的抑菌性结果显示，17株内生真菌具有一定的抑菌活性，其中，有8株内生真菌的抑菌作用并不显著，仅表现出较弱的抗菌效果(Φ﹤10 mm)；有6株内生真菌的抗菌效果中等(10 mm≤Φ﹤20 mm)；有3株内生真菌显示出较好的抑菌效果(Φ≥20 mm)，且这3种内生真菌经分子鉴定，其结果与形态学鉴定结果保持一致，分属于青霉属、链格孢属和叶点霉属。内生真菌具有抑菌性，源于内生真菌能产生具有抑菌性的物质[16-17]。虽然其产量通常比植物宿主低，但与植物宿主相比，内生真菌具有生长速度快、不受季节影响、易诱变等优势，可以作为新型天然农药或药物的重要生物来源，弥补天然植物开发因受资源限制不能无限制开采的缺点，因此备受研究者的青睐。在后续试验中，将把这3种内生真菌作为重点菌种对其代谢产物进行进一步分析，确定其抑菌成分和抑菌浓度，期望从油茶内生真菌中分离得到具有较高抑菌效果的新化合物。

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Diversity，Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi fromCamelliaoleifera

ZHANG Ting，ZUO Xuezhi，XU Yan

(College of Bioengineering，Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

To understand the classification,distribution feature and applied potential of endophytic fungi fromC.oleifera,we collected samples from five plantingregions in Hubei province in different seasons.Endophytic fungi were separated from theseC.oleiferafor the diversity and antimicrobial activity analysis.In this study,1 612 stains of ebdophytic fungi were isolated,which were categorized into 24 genera by morphological analysis.Sixty-six strains with no reproductive features were classified as sterile mycelia.The dominant groups werePencillium,AlternariaandColletotrichum,accounting for 21.09%,19.11% and 14.70% of isolated strains respectively.Diversity analysis of isolated strains in different regions indicates that endophytic fungi from Huanggang showed highest Shannon-wiener diversity index (2.44);the highest indexes were in stem(2.52) and in autumn(2.58) in different tissues and different seasons respectively.In general, the populations of endophytic fungi fromC.oleiferawere stable,the composition of endophytic fungi in the samples from different regions or different tissues was similar.Antimicrobial assay indicated that fermented extract in 17 of 24 chosen strains had antimicrobial activity,3 strains exhibited greater activity than the others,which belonged toPencillium,AlternariaandPhyllosticta,respectively.Our results demonstrated that endophytic fungi fromC.oleiferahad great antimicrobial activity,and were worth further studying.

Camelliaoleifera； endophytic fungi; isolation rate； diversity； antimicrobial activity

2016-08-13

湖北省教育厅科研项目(Q20134301)

张 婷(1980-)，女，湖北襄阳人，讲师，硕士，主要从事微生物资源利用研究。E-mail:ztxianyun@126.com

Q938.1；Q939.9

A

1004-3268(2017)04-0068-07