马铃薯茎叶中茄尼醇提取方法优化与比较

王秉鹏，蒙 静，郭 玫，黄新异，董方圆，邸多隆*

(1.甘肃中医药大学 药学院/甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州730000；2.中国科学院 兰州化学物理研究所 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000； 3.宁夏自治区农业综合开发办公室，宁夏 银川 750011)

马铃薯茎叶中茄尼醇提取方法优化与比较

王秉鹏1,2，蒙 静3，郭 玫1*，黄新异2，董方圆3，邸多隆2*

(1.甘肃中医药大学 药学院/甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州730000；2.中国科学院 兰州化学物理研究所 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000； 3.宁夏自治区农业综合开发办公室，宁夏 银川 750011)

为了探究马铃薯茎叶中茄尼醇适宜的提取溶剂和提取方法，选取从宁夏固原采收的同一批马铃薯茎叶为研究对象，分别以95%乙醇、甲醇为提取溶剂，并设置不同的提取次数和提取时间，优化了加热回流提取马铃薯茎叶中茄尼醇的方法，并比较了加热回流提取、冷浸提取和超声提取马铃薯茎叶中茄尼醇的效果。结果表明，采用95%乙醇加热回流提取马铃薯茎叶中茄尼醇，提取2次，每次提取1.5 h，茄尼醇提取率达到96.85%，明显高于甲醇作为提取溶剂(47.04%)；其浸膏得率为7.63%，与甲醇作为提取溶剂(8.07%)相当，可降低后期茄尼醇的精制和纯化的成本。该方法简便、可行，试剂还可反复回收利用，可行性强。

马铃薯； 茎叶； 茄尼醇； 提取方法

马铃薯(Solanumtuberosum)，茄科茄属1年生草本植物，原名阳芋，首载于《植物名实图考》[1]中，其本身即可食用，又可药用，性平味甘，可以治胃痛、痄肋、痈肿等疾病[2]。马铃薯茎分为地上茎和地下茎两部分，其中地下茎为人们日常生活中所食用的马铃薯块茎，而作为地上茎部分的马铃薯茎叶目前尚未被充分利用，尤其是其所含的茄尼醇[3]，更是亟待开发。

茄尼醇为一种不饱和的聚异戊二烯伯醇，属于四倍半帖烯醇，广泛存在于茄科植物中[3]。其本身具有消炎、抗菌、补血、降血脂和抗肿瘤等生物活性，而且高纯度的茄尼醇(含量≥ 90%)更是合成泛醌类药物辅酶Q10、维生素K2以及其他药物的重要中间体[4]。茄尼醇结构独特，人工合成过程非常复杂，且浪费大量试剂[5]，只能从植物中提取，目前全世界所用茄尼醇主要从烟叶中提取[6]，而烟草资源本来就紧缺，再加上现在烟草利用率逐步提高，国家对烟草行业的强制性管控[7]，使生产茄尼醇的成本日益昂贵，寻找代替烟草提取茄尼醇的原料势在必行。马铃薯茎叶中茄尼醇含量(0.1%～1%)与烟草中茄尼醇含量(0.3%～3%)相当[8-10]，故可选用马铃薯茎叶替代烟草提取茄尼醇，以缓解茄尼醇原料紧缺的局面。

目前,茄尼醇提取方法主要有微波辅助萃取[11]、超临界流体萃取提取[12]、超声提取[13]、匀浆提取[14]等，在这些提取方法中均用到石油醚、乙酸乙酯或6号溶剂等挥发性的有机溶剂，且部分设备成本高昂、操作工艺繁杂，再加上几乎全部用烟叶作为提取原料，因此不适合工业生产。鉴于此，以宁夏固原所产马铃薯茎叶为研究对象，以95%乙醇和甲醇为提取溶剂，采用高效液相色谱法(HPLC)测定其提取液中茄尼醇含量，以茄尼醇提取率和浸膏得率为提取指标，系统研究了提取方法、提取溶剂、提取时间等对马铃薯茎叶中茄尼醇提取分离效果的影响，确定最佳提取方法，为马铃薯茎叶中茄尼醇的开发利用及工业化生产提供有效的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料、试剂及仪器

于9、10月到宁夏固原马铃薯种植基地采收马铃薯地上部分的茎叶，去除主茎及其他杂质后洗净泥土，自然阴干，带回实验室剪切成1.0 cm左右的小段。

药品与试剂：95%乙醇、甲醇(均为分析纯，天津利华隆博医药化学有限公司)，甲醇、无水乙醇(均为色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)，茄尼醇对照品(批号：20140219，纯度≥97%，上海士峰生物科技有限责任公司)。

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪(Agilent Technologies，USA)，包括 G1311A 四元泵、G1315D DAD检测器、G1322B手动进样器；AT-950(Heater and Cooler)色谱柱柱温箱(天津奥塞恩斯仪器有限公司)；HWS26电热恒温水浴锅(上海恒科技术有限公司)；Rotavapor R-3旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；SHZ-DⅢ型循环水真空泵(郑州市亚荣仪器有限公司)；ZFD-9050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；BT224S电子天平(Sartorius公司)；SHA-B双功能水浴恒温振荡器(江苏正基仪器有限公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试验设计

1.2.1 茄尼醇含量的检测 采用HPLC法测定。HPLC条件：C18液相色谱柱(Spherisorb，250 mm×4.6 mm)；柱温30 ℃；流动相为甲醇∶无水乙醇(80∶20，V/V)；检测波长210 nm；流速1.0 mL/min。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取茄尼醇对照品4.5 mg，加甲醇(色谱纯)溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，即得茄尼醇对照品溶液。

1.2.3 马铃薯茎叶中茄尼醇的提取方法优化

1.2.3.1 加热回流提取试剂的筛选 精密称取5 g剪切成段的马铃薯茎叶于烧瓶中，分别加入50 mL(10倍量)甲醇(分析纯)、95%乙醇(分析纯)于电热恒温水浴锅中，80 ℃加热回流提取2.0 h，提取2次，每次提取结束后过滤，分别将滤液旋转蒸发浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)后用95%乙醇定容至25 mL容量瓶中，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，分别测定茄尼醇含量，测定结束后，将提取液分别用旋转蒸发仪浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，测定浸膏得率。提取率=试验所得茄尼醇质量/总茄尼醇质量×100%，总茄尼醇质量为试验前用标准品定量测定的马铃薯茎叶中所含全部茄尼醇含量；浸膏得率=浸膏质量/马铃薯茎叶质量×100%。

1.2.3.2 加热回流提取次数的考察 精密称取5 g剪切成段的马铃薯茎叶于烧瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析纯)于电热恒温水浴锅中，80 ℃加热回流提取2.0 h，分别提取1次、2次、3次，提取结束后过滤，分别将每次的滤液旋转蒸发浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)定容至25 mL容量瓶中，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，测定茄尼醇含量，测定结束后将提取液分别用旋转蒸发仪浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，测定浸膏得率。

1.2.3.3 加热回流提取时间的考察 精密称取5 g剪切成段的马铃薯茎叶于烧瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析纯)于电热恒温水浴锅中，80 ℃分别加热回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h，各提取2次，每次提取结束后过滤，分别将每次的滤液旋转蒸发浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)定容至25 mL容量瓶中，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，测定茄尼醇含量，测定结束后将各提取液分别再用旋转蒸发仪浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，测定浸膏得率。

1.2.3.4 冷浸提取方法优化 精密称取5 g剪切成段的马铃薯茎叶于250 mL锥形瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析纯)(称定质量)置于水浴恒温振荡器中(25 ℃，60 r/min)振摇提取，0.5 h后用0.45 μm的微孔滤膜将提取液滤过少许，取续滤液测得提取液中茄尼醇含量(每次测定后继续称定质量，加95%乙醇补足减失的质量)，之后以0.5 h为时间间隔继续测定，直至茄尼醇含量稳定，分别冷浸提取2次，提取结束后过滤，最后将滤液分别用旋转蒸发仪浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，测定浸膏得率。

1.2.3.5 超声提取方法优化 精密称取5 g剪切成段的马铃薯茎叶于250 mL锥形瓶中，加入50 mL(10倍量)95%乙醇(分析纯)(称定质量)于数控超声波清洗器中(25 ℃，70 Hz)超声提取，提取时间分别为5、10、15、20、25、30、35 min，直接将少许提取液用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液测定茄尼醇含量直至稳定(每次测定后继续称定质量，加95%乙醇补足减失的质量)，再在同样条件下提取第2次，直至提取的茄尼醇含量达到稳定，提取结束后过滤，最后将滤液分别用旋转蒸发仪浓缩(40 ℃，≥0.07 MPa)至干，测定浸膏得率。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2010、Origin 8.5软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 加热回流提取马铃薯茎叶中茄尼醇的方法优化结果

2.1.1 提取试剂的筛选结果 从表1可以看出，采用95%乙醇加热回流提取，马铃薯茎叶中茄尼醇的提取率(96.85%)明显高于甲醇加热回流提取的结果(47.04%)，且浸膏得率与甲醇提取相当，故选用95%乙醇(分析纯)作为马铃薯茎叶中茄尼醇的提取试剂。

表1 不同提取试剂对马铃薯茎叶中茄尼醇提取效果的影响

2.1.2 提取次数的确定 从表2可以看出，马铃薯茎叶提取2次后，其茄尼醇提取率达到96.85%；提取第3次，茄尼醇的提取率仅为3.14%，且相对偏差结果较大。说明茄尼醇在第3次提取时已经不稳定，故从节约时间和试剂以及茄尼醇稳定性的角度考虑，将马铃薯茎叶中茄尼醇的提取次数定为2次。

表2 加热回流提取次数对马铃薯茎叶中茄尼醇提取效果的影响

2.1.3 提取时间的确定 从图1和表3可以看出，随着提取时间的延长，茄尼醇含量、提取率、浸膏得率等参数都相应升高，在加热回流提取1.5 h后，再延长提取时间，茄尼醇含量、总提取率和浸膏得率的变化不大，说明提取1.5 h后，茄尼醇提取率已达到稳定，故将加热回流提取时间定为1.5 h。

图1 加热回流提取不同时间的茄尼醇含量和浸膏得率表3 加热回流提取时间和提取次数对马铃薯茎叶中茄尼醇 提取效果的影响

提取时间/h提取次数提取率/%2次总提取率/%浸膏得率/%2次总浸膏得率/%0.5133.5960.944.225.59227.351.371.0148.4474.225.136.58225.781.451.5176.5496.856.027.63220.311.612.0183.5997.656.277.96214.061.69

2.2 冷浸提取马铃薯茎叶中茄尼醇的方法优化结果

从图2可以看出，在第1次冷浸提取至2.5 h后，茄尼醇含量基本保持稳定，说明在提取2.5 h后基本达到稳定；而在第2次冷浸提取至1.0 h后，茄尼醇含量基本保持稳定。根据2次提取的结果，将冷浸提取的时间定为2.5 h。从表4可以看出，冷浸提取2次的总提取率为57.34%,总浸膏得率为1.88%。

图2 冷浸提取次数对马铃薯茎叶中茄尼醇提取效果的影响表4 冷浸提取马铃薯茎叶中茄尼醇相关考察指标结果

提取次数项目提取率/%平均提取率/%RSD/%2次总提取率/%浸膏得率/%平均浸膏得率/%RSD/%2次总浸膏得率/%1平行132.4632.390.357.341.021.011.811.88平行232.321.002平行125.1324.951.00.860.871.88平行224.770.88

2.3 超声提取马铃薯茎叶中茄尼醇的方法优化结果

从表5可以看出，在超声提取10 min时，马铃薯茎叶中茄尼醇提取率达到最大值，之后随着提取时间的延长，茄尼醇提取率逐渐降低，在提取35 min时降低5.4%，而在整个提取过程中，随着提取时间的延长，浸膏得率逐渐升高，其原因可能在于10 min后茄尼醇不再溶出，只有一些极性较大的醇溶性杂质溶出，致使浸膏得率增加。因此，在茄尼醇提取率达到最大值后没必要继续提取，避免溶出杂质过多，增大茄尼醇精制的压力，故从节省时间和降低消耗的角度考虑，超声提取马铃薯茎叶中茄尼醇的提取时间为10 min。

表5 超声提取后相关考察指标结果

注：表中数据为超声提取茄尼醇2次的试验数据之和。

2.4 不同方法提取马铃薯茎叶中茄尼醇的效果比较

由表6可见，95%乙醇加热回流提取与其他几种提取方法相比，其茄尼醇含量和提取率均较高，故95%乙醇加热回流提取为马铃薯茎叶中茄尼醇的最佳提取方法。

表6 不同方法提取马铃薯茎叶中茄尼醇的效果比较 %

3 结论与讨论

茄尼醇结构独特，极性较小，只能用有机试剂提取。本研究分别用95%乙醇、甲醇作为马铃薯茎叶中茄尼醇的提取试剂，其结果表明，95%乙醇提取茄尼醇时提取率较高，故选用95%乙醇为马铃薯茎叶中茄尼醇的提取试剂；在确定提取试剂后又探讨了加热回流提取时间和提取次数对马铃薯茎叶中茄尼醇提取效果的影响，并比较了加热回流提取、冷浸提取和超声提取等提取方法的差异，最后确定马铃薯茎叶中茄尼醇的提取方法为，95%乙醇提取加热回流提取1.5 h，提取2次，茄尼醇的提取率达到96.85%。

在确定提取时间的试验中，比较了不同时间内的2次提取效果，在第1次提取结束后，茄尼醇提取率、浸膏得率都随着提取时间的延长而提高；在第2次提取结束后，随着提取时间的延长，浸膏得率升高，茄尼醇提取率则降低，而此时的茄尼醇提取率是相对茎叶而言的，不是浸膏中的提取率，说明随着提取时间的延长，茄尼醇有所降解，此结论在超声提取的结果中也有体现。在实验室条件下，茄尼醇的降解幅度可能较小，影响不大，但在工业生产中，由于试剂和原料的用量呈几何增长，茄尼醇的降解势必会造成工业成本的增加以及试剂、原料的浪费，因此，在工业生产过程中需要严格考虑提取时间这一影响因素。

研究表明，茄尼醇在植物中除以游离状态存在外，还有一部分以茄尼醇酯的形式存在[15]，茄尼醇酯需经碱或脂肪酶皂化断裂酯键才能生成游离茄尼醇[16-17]。因此，本研究中的提取率仅指游离茄尼醇的提取率，而关于茄尼醇酯的皂化研究将会在后续研究中开展，茄尼醇提取率将会进一步提高。

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Optimization and Comparison of Extracting Methods of Solanesol in Potato Stem and Leaf

WANG Bingpeng1,2，MENG Jing3,GUO Mei1*,HUANG Xinyi2,DONG Fangyuan3,DI Duolong2*

(1.Department of Pharmacy，Gansu University of Medicine/Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province，Lanzhou 730000,China; 2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics of Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000,China; 3.Comprehensive Development Office of Agriculture in Ningxia Autonomous Region，Yinchuan 750011,China)

In order to investigate the optimal extraction solvents and extraction methods，the same batch potato stem and leaf which was collected from Guyuan，Ningxia was as material.Solanesol was extracted through heating reflux extraction with 95% ethanol and methanol as extraction solvents under different extraction times and extraction time，and extraction effect of solanesol by heating reflux extraction，cold-soaked extracting and ultrasonic extraction methods were compared.The results showed that the extraction ratio was up to 96.85% with 95% ethanol as extraction solvent under extraction times of 2 and extraction time of 1.5 h,which was much higher than that with methanol as extraction solvent(47.04%),and the dry extract yield was 7.63% with 95% ethanol as extraction solvent，which was equivalently with that methanol as extraction solvent(8.07%),which could reduce the cost of refine and purification of solanesol.This method was simple，feasible,and the solvent could be recycled，which had high feasibility.

potato; stem and leaf; solanesol; extraction methods

2016-09-27

2016宁夏农业综合开发科技推广项目(NTKJ2016-09-03)

王秉鹏(1988-),男，甘肃张掖人，在读硕士研究生，研究方向：中药有效成分与质量标准。 E-mail:wbpzhongyao@163.com

*通讯作者：郭 玫(1963-)，女，湖北宜昌人，教授，硕士，主要从事中药有效成分与质量标准研究。E-mail:guomeig@sina.com 邸多隆(1964-)，男，甘肃张掖人，研究员，博士，主要从事天然产物化学和分析化学研究。 E-mail:didl@licp.cas.cn

S532;F316.5

A

1004-3268(2017)04-0138-05