泛素/类泛素化调控DNA损伤修复机制研究进展

陈圳川，冷泠，季守平

军事医学科学院 野战输血研究所组织工程研究室，北京 100850

泛素/类泛素化调控DNA损伤修复机制研究进展

陈圳川，冷泠，季守平

军事医学科学院 野战输血研究所组织工程研究室，北京 100850

细胞对DNA损伤进行精确、高效修复的机制被称为DNA损伤应答机制，增殖细胞核抗原（PCNA）在DNA损伤修复机制中起着核心的作用。当细胞遭遇到DNA损伤时，PCNA通过泛素化及类泛素化的翻译后修饰对DNA修复过程进行调控。本文重点阐述DNA损伤修复的不同方式，以及泛素/类泛素化相关蛋白参与调控DNA损伤修复过程的研究进展，并分析了DNA损伤修复与机体的衰老和发育之间的密切关系，为研究DNA修复蛋白的缺失在相关疾病中的作用机制提供新思路。

DNA损伤修复；增殖细胞核抗原；泛素；类泛素

1 DNA损伤

DNA损伤可能来自机体的内在因素，例如活性氧、细胞新陈代谢的副产物以及DNA在复制过程中由于拓扑异构酶失活而导致的错配；也可能来自电离辐射（IR）、紫外光（UV）照射及自然界中的其他致癌物等外在因素。DNA损伤会导致基因突变和细胞衰老的发生[1]。细胞发生DNA损伤并对其进行精确、高效修复的机制被称为DNA损伤应答机制（DNA damage response，DDR），其作用是保护机体免受DNA损伤的不利影响。DNA损伤后会发生一系列反应事件，其中包括DNA损伤应答蛋白及传递蛋白的招募和定位，从而形成可见的亚细胞核聚集点（nuclear foci）[2]。一系列的信号通路将这些事件联系起来，使含有换能效应蛋白（transducer effector proteins）的染色质复合体转移到细胞核中，从而起到放大DNA损伤信号的作用。细胞对DNA损伤的应答很大程度上取决于自然界的损伤方式，例如，DNA双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）大多数是由细胞毒素引起的[3]。整个DNA损伤应答的过程都是通过蛋白的翻译后修饰进行调控，包括磷酸化、甲基化、泛素化和类泛素化等[3]，从而改变蛋白质的稳定性、作用位点以及生物活性。

2 DNA修复

DNA修复蛋白缺失的临床表现为免疫缺陷病、不孕不育、神经退行性疾病、癌症、衰老及其他生理缺陷。基因组的不稳定性是癌症的显著特点，一条或多条DNA损伤修复通路的缺失可以导致多种癌症发生。

2.1 DNA单链断裂（single-strand breaks，SSBs）的损伤修复（SSB repair，SSBR）

DNA单链损伤是DNA双螺旋结构中的单链发生断裂，其损伤位点往往伴随着单个核酸的缺失以及3'和5'端碱基的损伤。SSBs通常由电离辐射以及治疗过程中的一些化学因素诱发产生，能引起DNA螺旋结构中脱氧核糖的瓦解，使DNA螺旋结构直接成为碱基切除修复（base-excision re⁃pair，BER）过程中的中间产物；或者，使其被拓扑异构酶1（topoisomerase 1，TOP1）清除。SSBs修复不及时会导致DNA复制叉垮塌及转录停止，其后促进SSB感应蛋白PARP［poly（ADP-ribose）poly⁃merase 1］活性增强[4]。DNA单链损伤修复由PARP调控，pADPr链［chainsofpoly（ADP-ri⁃bose）］在DNA损伤位点附近合成，并促进DNA修复因子如XRCC1（X-ray repair cross-complement⁃ing protein 1）及LIG3（DNA ligase 3）[4]在损伤位点的招募。研究发现，DNA单链断裂损伤修复的缺失与遗传性神经退行性疾病的发生有密切关系[4]。

2.2 DNA双链断裂的损伤修复

DNA双链断裂由电离辐射、拟放射药物（ra⁃diomimetic agent）、拓扑异构酶毒剂等诱导产生。DNA双链断裂被各种各样的DSB应答蛋白发现并发出信号，通过2种不同的修复方式被修复。在人源细胞中发现的2条修复通路分别是同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）。

在HR修复通路中参与DSB应答的蛋白是MRN蛋白复合体，包括MRE11（meiotic recombina⁃tion 11）、RAD50和NBS（nijmegen breakage syn⁃drome 1）[5-8]。MRE11具有结合DNA及核酸外切酶的活性并保持DNA末端的稳定性，与结合伴侣CtIP（也被称作retino blastoma binding protein 8，RBBP8）一起促进HR修复通路的产生[9-10]。HR修复通路发生在细胞周期的S/G2阶段，相对于NHEJ修复通路是一个缓慢的过程，如BRCA1和BRCA2等这些在HR修复通路中关键因子基因的遗传缺失会导致一系列癌症的发生[11]。

在NHEJ修复通路中参与DSB应答的蛋白是Ku蛋白[12]。Ku蛋白是由相对分子质量分别为70×103和80×103（Ku70和Ku80）的2段多肽构成的异构二聚体[13]，它作为高效的DNA结合蛋白结合单链的DNA末端[14-15]。当发生DSB后，Ku蛋白能迅速地与DNA结合并稳定DNA末端，这种结合不依赖于DNA的碱基顺序，为DNA连接酶保留作用位点。与此同时，Ku蛋白能招募NHEJ复合体中的其他组分，包括DNA-PKcs[16]、XRCC4/LIG4[17-18]、XLF[19]及新发现的PAXX蛋白[20-21]，使DNA末端得以连接和修复。

2.3 跨损伤DNA合成（translesion synthesis，TLS）

跨损伤DNA合成是一种在DSB中避免DNA复制叉停止的旁路机制。当DNA发生损伤时，结合在DNA上的复制性聚合酶复合体会停止在DNA损伤位点，TLS聚合酶便会与复制性聚合酶相置换，以损伤核苷酸为模板，通过特异的TLS聚合酶（大多数是Y家族聚合酶），使碱基掺入复制终止处而恢复DNA损伤位点之后的DNA合成。跨损伤修复可分为无错性修复（error-free repair）和易错性修复（error-prone repair）[22]。

除了DNA DSBs修复、SSBs修复和跨损伤DNA合成这些损伤方式以外，DNA损伤修复还包括DNA碱基损伤修复和DNA碱基错配修复等。

3 增殖细胞核抗原与DNA损伤修复

增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在DNA损伤修复机制中起着核心的作用。PCNA作为一个稳定的“站台”，在损伤修复过程中招募一系列复制相关蛋白。PCNA与DNA聚合酶polδ结合，DNA进行复制。当复制中的细胞遭遇到DNA损伤时，包括泛素化及类泛素化在内的多种翻译后修饰通过修饰PCNA对DNA损伤修复进行调控[23-25]。当表皮细胞长时间暴露在紫外线辐射中时，RAD6-RAD18复合体能够介导PCNA第164位赖氨酸残基发生高度的单泛素化，从而导致复制性DNA聚合酶发生变化[26]，例如DNA聚合酶Y家族跨损伤合成聚合酶中的polδ和polη[27]。细胞发生UV损伤时，PCNA 164位点单泛素化可以使结合于PCNA上的DNA聚合酶从polδ转换成跨损伤合成DNA聚合酶polη。在正常情况下，polη的UBZ结构域被单泛素化，当DNA遭受UV损伤时，polη被一种未知的去泛素化酶（USP）去泛素化，结合在泛素化的PCNA上。此时，PCNA重新释放跨损伤合成聚合酶polη[28]，介导polη向损伤部位聚集而启动具有错配倾向的跨损伤复制过程。

4 泛素与DNA损伤修复

泛素是由76个氨基酸残基构成的在进化上高度保守的小分子蛋白。人类基因组中有4种基因能编码泛素，分别是UBC、UBB、UBA52和UBA80[29]。泛素因在网状细胞提取物中能够调节依赖ATP细胞的降解而被发现，依赖ATP在E1-E2-E3酶联体系的作用下与底物赖氨酸结合，从而对底物进行单泛素化（mono-ubiquitination）、多重单泛素化（multiple mono-ubiquitination）以及多聚泛素化（polyubiquitination）[30]。与泛素共价结合的蛋白能被蛋白酶体识别并降解，是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。泛素化及类泛素化蛋白在细胞分裂、自噬、DNA修复、免疫应答及细胞消亡等方面起关键作用[31-33]。去泛素化是指泛素化的蛋白在特异性水解酶——去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）的作用下解离泛素分子的过程。去泛素化酶能水解泛素间的键，也能水解泛素与靶蛋白之间的键，并重新释放出泛素分子[34]。在DNA双链修复过程中，复制后修复蛋白Rad6是泛素的E2酶[29-30]，它能协助泛素E3酶Rad18单泛素化PCNA的164位赖氨酸残基[35]。随后，单泛素化的PCNA控制结合在复制叉的DNA复制聚合酶转变为DNA损伤修复聚合酶。PCNA单泛素化是DNA损伤修复的重要标志，因此，泛素化在DNA损伤修复通路中起到了重要的调节作用。

5 类泛素蛋白与DNA损伤修复

类泛素蛋白（ubiquitin-like proteins，UBLs）是一类与泛素类似的小蛋白家族。据报道，类泛素蛋白含有与泛素同源的结构域，其同源性为15%～16%[32]。UBLs可以分为2个亚家族：类泛素结构域家族UDP和类泛素家族修饰蛋白家族ULM。UDP可以与泛素及泛素修饰蛋白发生非共价结合。ULM具有与泛素单体或二聚体同源的结构域，可以在E1-E2-E3酶联体系的催化下通过C端的双甘氨酸基团与底物蛋白质共价结合[36]，其代表成员有ISG15、FUB1、NEDD8、SUMO、Urm1、UBL5、Ufm1和FAT10等[32]。

5.1 ISG15

ISG15（interferon-stimulated gene 15）是由人ISG15基因编码的相对分子质量为17×103的分泌性蛋白[37]。当细胞遭受UV辐射时，类泛素蛋白ISG15及其E1酶UBE1L和E2酶UBCH8表达量增加，PCNA作为靶向蛋白被ISG15类泛素化[35]。DNA发生UV损伤时，PCNA被单泛素化，从而招募polη进行跨损伤合成。首先，ISG15的E3酶结合单泛素化PCNA，使PCNA发生单体ISGylation及二聚ISGylation。二聚ISGylation的PCNA招募PIP盒，被去泛素化酶USP10去泛素化。接着，PCNA释放polη，终止跨DNA损伤合成。最后，UBP43介导ISG15从PCNA上分离，DNA polδ聚合酶重新结合PCNA，DNA复制重新开始[35]。ISG15通过修饰PCNA在TLS修复终止以及随后的DNA复制重新开始过程中发挥重要的作用[35]。

5.2 NEDD8

类泛素化蛋白NEDD8（neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 8）与泛素序列的相似性为58%，在心脏和骨骼肌中高表达[38]，其共价修饰的底物是由8个基因（cul1、2、3、4A、4B、5、7、PARC）编码而成的cullin蛋白家族（cullins），其羧基端是Neddylation的作用位点[39]。研究表明，未修饰的Ku蛋白以稳定的环状结构结合在DNA末端，导致DNA无法修复，从而影响细胞的生理活动。当DNA发生损伤修复时，结合在DNA上的Ku80蛋白48位赖氨酸残基被含有cullin1的蛋白复合体SCFFBX212（Skp1-Cul1-F-box）多聚泛素化，使Ku80蛋白与DNA分离，使DNA损伤修复正常进行[3]。在人源细胞中，抑制NEDD8共价修饰底物的因子大多是DNA损伤因子，例如丝酶素C、顺铂等。也有研究表明，在DSB修复中，NEDD8能直接作用于DNA的损伤位点，蛋白RNF111和RNF168作为NEDD8的E3连接酶，介导NEDD8共价修饰DNA损伤位点[40]。NEDD8通过作用于KU80蛋白从而与DNA双链损伤修复有着密切联系。

5.3 SUMO

类泛素化蛋白 SUMO（small ubiquitin-like modifier）是一类相对分子质量约11×103且高度保守的蛋白质家族，为大多数真核细胞生存所必需。据报道，SUMO E3连接酶hMMS21通过催化Smc5/6复合体发生SUMOylation而参与DNA双链断裂的修复过程。当DNA发生单链损伤时，E2酶UBC9介导SUMO和泛素竞争修饰PCNA第164位赖氨酸残基，从而决定DNA修复为TLS无错性修复还是易错性修复。

6 结语

DNA损伤修复是进化上保守的生理机制，其目的是维持细胞基因的稳定。当DNA损伤达到不可修复的程度时，细胞将会凋亡或衰老，从而防止损伤产生的突变遗传至下一代细胞，提示我们DNA损伤修复能力与衰老密切相关。此外，最近研究表明DNA损伤与胚胎干细胞的发育有密切关系[41]。胚胎干细胞受辅助因子OCT4、SOX2、NANOG[42-43]、染色质调节因子、未编码RNA及其他信号通路的效应因子转录调控。研究表明DNA损伤修复复合体XPC-RAD23B-CETN2可作为干细胞的辅激活蛋白（SCC）激活OCT4/SOX2转录激活活性，从而诱导胚胎干细胞的分化[41]。因此，DNA损伤修复不仅与癌症等多种疾病有关，而且与机体的衰老和胚胎的生长发育有着重要而密切的联系，但其具体的作用机制还不为人知。DNA损伤修复中的蛋白信号调控通路以及蛋白与蛋白之间的相互作用机理远比目前人们所了解认识的要复杂得多，因此探究DNA损伤修复机制成为当今一大研究热门。

泛素化和类泛素化是短暂且可逆转的翻译后修饰方式，泛素化/去泛素化酶结合修饰底物，通过翻译后修饰与DNA损伤修复相关的蛋白改变其相关生物活性，成为生命功能中重要的调节因子。在DNA发生损伤修复时，泛素和类泛素蛋白可以修饰作为底物的PCNA，不同泛素化或类泛素化的PCNA参与不同的损伤修复机制，这提示我们PCNA的泛素化或类泛素化/去泛素化或去类泛素化可能是一类控制DNA损伤修复的“分子开关”，但其具体机理有待进一步探究。因此，以DNA损伤修复过程中某些关键因子的泛素化或类泛素化为研究对象，找到调控DNA损伤修复机制中的“分子开关”，或许能成为打开癌症的发生以及机体的衰老及发育奥秘大门的“金钥匙”。

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Progress on the Mechanism of DNA Repair Regulated by Ubiquitination/Ubiquitin Like Modification

CHEN Zhen-Chuan,LENG Ling,JI Shou-Pi*
Tissue Engineering Lab,Beijing Institute of Transfusion Medicine,Beijing 100850,China

The accurate and efficient repair of DNA damage in cell,is collectively termed as DNA damage re⁃sponse.Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）plays a crucial role in DNA damage response.PCNA regulates the process of DNA repair via ubiquitination/ubiquitin-like modification when DNA is damaged.In this review,we summarized several cellular pathways of DNA repair and the current advance of ubiquitination/ubiquitin-like modifi⁃cation involving in DNA repair.Further,we discussed the connection between the DNA damage repair and the ag⁃ing or development of organism,to provide new clues to study the function of DNA repair proteins deficiency in the related diseases.

DNA repair;proliferating cell nuclear antigen;ubiquitin;ubiquitin-like proteins

Q25

A

1009-0002（2017）02-0169-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.022

2016-10-08

国家自然科学基金青年项目（31400701）

陈圳川（1992-），男，硕士研究生

季守平，（E-mail）jishouping@yahoo.com

*Corresponding anthor,E-mail:jishouping@yahoo.com