应用DNA分子标记鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的研究

2017-04-12巩高瑞张晋丹成桂建芳

水生生物学报 2017年2期

巩高瑞张晋丹成桂建芳,梅洁

(1. 华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 武汉 430070; 2. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072)

巩高瑞1张晋1丹成1桂建芳1,2梅洁1

为区分黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli Richardson)及其杂交种, 前期研究构建了一个YY超雄黄颡鱼的BAC文库并筛选到了一个包含性别连锁标记Pf62-Y的BAC克隆。研究对该BAC克隆进行测序并鉴定到了一个新基因Inad-like, 而且Inad-like的外显子序列在X和Y染色体上基本一致。通过黄颡鱼Inad-like的外显子序列及序列的保守性我们设计引物在瓦氏黄颡鱼中扩增获得了其部分内含子序列。通过内含子序列比对, 发现瓦氏黄颡鱼比黄颡鱼少了一个DNA片段。基于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的显著遗传差异, 设计了一对引物, 该引物在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中分别扩增出1908和1178 bp DNA片段, 而且在杂交黄颡鱼中同时扩增出这两个DNA片段。总之, 这个新的遗传标记提供了一种稳定、高效识别黄颡鱼及其与瓦氏黄颡鱼杂交种的方法。

黄颡鱼; 瓦氏黄颡鱼; 杂交黄颡鱼; 分子标记; 种类鉴定

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)是我国江河、湖泊中的一种重要的经济鱼类, 广泛分布于我国淡水水体中。黄颡鱼在分类上隶属于鲶形目, 鲿科, 黄颡鱼属, 主要有黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼(江黄颡鱼)、中间黄颡鱼和光泽黄颡鱼等4种, 目前用于人工养殖的主要是黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼。黄颡鱼雄性比雌性生长快, 在养殖的第二年, 雄性黄颡鱼的体重约是雌性的2—3倍。因此, 在生产实践中, 人们通过各种人工控制方法培育全雄鱼。刘汉勤等利用雌激素诱导和人工雌核发育技术, 成功地从黄颡鱼XY生理雌鱼雌核发育获得了YY超雄鱼[1]。但传统的方法需要杀掉雄鱼从精巢获得精液进行测交实验才能鉴定出其父本为遗传YY或XY雄鱼,这些因素阻碍了其在生产上的应用。基于两性繁殖的黄颡鱼家系和人工雌核发育获得的XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼, 中国科学院水生生物研究所桂建芳研究员课题组结合BSA分析方法和个体筛选, 分离得到了黄颡鱼X和Y染色体连锁的AFLP标记, 并将它们转化为黄颡鱼X和Y染色体连锁的SCAR标记(Pf33和Pf62), 建立了黄颡鱼遗传性别PCR鉴定方法[2]。由此开拓出了一条X和Y染色体连锁标记辅助的全雄鱼培育技术路线[3,4]。但是这些性连锁的SCAR标记只在以上一个人工养殖群体中成功测试, 而且引物Pf62-X和Pf62-Y仅两个碱基的差异, 可能会使它们的应用有一定的局限性。通过基因组步移技术进一步得到等位基因Pf62-X和Pf62-Y侧翼的基因组序列(长度分别为5362和8102 bp),筛选出能广泛鉴定黄颡鱼野生和养殖群体性别的分子标记[5]。

瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli Richardson),俗称江黄颡, 为我国特有种, 该鱼生长速度显著快于普通黄颡鱼, 最大个体可达1850 g[6]。瓦氏黄颡鱼在野生及养殖群体中雌雄生长速度差异较大, 雄鱼体重通常大于雌鱼50%左右, 有的甚至大于雌鱼一倍以上[6,7]。瓦氏黄颡鱼的仔、稚、幼鱼的生长和成活率显著高于黄颡鱼[8]。以黄颡鱼为母本, 以瓦氏黄颡鱼为父本杂交获得的子一代杂交黄颡鱼,从形态特征上比较接近黄颡鱼, 但其在受精率和生长速度上比黄颡鱼有明显的优势[9,10]。杂交黄颡鱼作为近年来崭露头角的一种养殖新品种, 市场前景非常看好, 因此, 近年来全雄黄颡鱼和杂交黄颡鱼在黄颡鱼养殖中占有相当大的比例。

目前, 从形态学上较难区分杂交黄颡鱼和普通黄颡鱼的苗种和成鱼。养殖实践表明, 以黄颡鱼为母本、瓦氏黄颡鱼为父本的一龄杂交后代是不育的, 不能用于后期的苗种制备。随着DNA分子标记技术的发展和成熟, 利用DNA标记进行种间鉴定成为可能。我们构建了YY超雄鱼的BAC文库, 筛选到了包含Pf62-Y标记的BAC克隆并进行测序, 与性腺转录组信息进行比较[11,12], 发现该BAC克隆含有一个Inad-like基因; Pf62-Y标记定位于Inad-like基因的内含子上(结果未发表)而且Inad-like基因的外显子在X和Y染色体上基本一致。由于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼同为黄颡鱼属, 亲缘关系比较近, 我们用黄颡鱼Inad-like基因的外显子序列设计引物在瓦氏黄颡鱼中进行扩增。我们扩增出瓦氏黄颡鱼Inadlike基因的部分内含子序列。通过Inad-like基因在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中的序列差异, 我们筛选得到了一对可以将黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼以及其杂交种准确鉴定出来的标记, 为黄颡鱼下一步的育种研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼取样于武汉市江夏区上涉湖养殖基地。

1.2 基因组DNA的提取

取鳍条0.2 g左右, 使用醋酸铵法提取基因组DNA, 将DNA溶于100 μL的超纯水中, 4℃保存备用。利用琼脂糖凝胶电泳法检测总DNA的完整性,用紫外分光光度计(Thermo, NanoDrop 2000, 美国)检测DNA浓度和质量。

1.3 PCR扩增

所用引物为经筛选得到的Pfv标记(Pfv-F 5′-TTTCCATCAGCATCCCCTCA-3′, Pfv-R 5′-AGCTCGGAGCCTTCATTCC-3′)。PCR反应体系为10 μL: 模版1 μL (50 ng/μL), 上下游引物各0.5 μL (10 μmol/μL), 2×Es Taq Master Mix (Dye) 5 μL, 加ddH2O补至10 μL。PCR反应程序为: 94℃预变性3min, 34个循环(94℃ 30s, 61℃ 30s, 72℃ 1min 45s), 72℃ 5min。PCR反应在T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, 美国)上进行。

1.4 纯化回收及测序

黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼PCR产物于1%琼脂糖胶上进行电泳, 回收(E.Z.N.A Gel Extraction Kit, OMEGA, 美国), 连接到pMD-18T载体(TaKaRa, 日本), 之后热激转化至Trans5α感受态细胞(北京全金式)。经PCR检测选取阳性克隆测序。

1.5 序列比对

黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼测序结果用DNAMAN 8进行比对分析。

2 结果

2.1 黄颡鱼Inad-like基因的结构示意图

Inad-like基因共包含18个外显子, ORF长度为2982 bp。Pfv标记的上下游引物分别位于第6和第7个外显子序列(图 1)。

2.2 黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼扩增序列的比对

通过使用Pfv引物扩增出瓦氏黄颡鱼Inad-like基因部分序列同黄颡鱼序列进行比对可以发现(图 2), 瓦氏黄颡鱼该片段大小为1178 bp, 较黄颡鱼的1908 bp少了730 bp。

2.3 黄颡鱼, 瓦氏黄颡鱼及其杂种的分子鉴定

Pfv引物在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种中的PCR产物凝胶电泳图(图 3)可直观的进行区分。实验鱼的雌雄性别通过解剖鉴定。如图 3所示, 黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各有一条条带, 条带大小分别为1908和1178 bp, 杂交黄颡鱼由于为黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的杂交种, 出现大小为1178和1908 bp的两条条带, 从而可以准确鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼。结果显示, 该鉴定引物扩增的PCR产物大小在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种中没有明显的雌雄差异。

3 讨论

随着DNA分子标记技术的发展和成熟, 应用DNA分子标记鉴定近缘物种已成为可能。DNA分子标记具有准确可靠、成本较低、简捷等特点。目前, 在鱼类中已有报道的DNA分子标记技术包括随机扩增多态性脱氧核糖核酸技术(RAPD), 限制性片段长度多态性(RFLP), 微卫星脱氧核糖核酸(SSR), 扩增片段长度多态性(AFLP)和单核苷酸多态性(SNP)标记等[13]。

图 1 黄颡鱼Inad-like基因的结构示意图Fig. 1 Structure of Inad-like gene in Pelteobagrus fulvidraco

图 2 黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼扩增序列比对结果Fig. 2 Sequence alignment between Pelteobagrus fulvidraco and Pelteobaggrus vachelli

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)隶属鲶形目(Siluriformes)、鲶科(Siluridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus)。黄颡鱼属主要有黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)、中间黄颡鱼(Pelteobagrus intermedius)和光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus)。应用形态学标准对黄颡鱼进行分类尚存在一些争议, 研究人员试图运用分子标记技术来鉴别不同种类的黄颡鱼。童芳芳等应用RAPD和SCAR复合分子标记法对湖北境内采集的光泽黄颡鱼、黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼种类进行鉴别, 但没有得到只针对一种黄颡鱼的特异引物[14]。肖调义等利用RAPD技术对长江流域洞庭湖4种黄颡鱼种群的遗传多样性进行分析, 运用聚类分析(UPGMA)的方法建立聚类图, 探讨了4种黄颡鱼系统演化的亲缘关系。其中的RAPD引物多态性比较高, 需要更多的个体来进一步鉴定和验证[15]。养殖实践表明, 杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)具有受精率和存活率高、生长快等优势, 但从形态特征上较难区分杂交黄颡鱼与黄颡鱼[9,10]。近年来杂交黄颡鱼的养殖产量持续上升, 迫切需要一种准确可靠、成本较低、简捷的DNA分子标记来鉴定。本研究根据黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组序列的差异, 设计了单对引物能准备区分黄颡鱼, 瓦氏黄颡鱼和杂交黄颡鱼, 而且该扩增片段在单个物种中不存在多态性, 鉴定结果准确。

图 3 Pfv引物对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的PCR产物凝胶电泳图Fig. 3 Electrophoresis results of PCR products by using Pfv primers in Pelteobagrus fulvidraco, Pelteobaggrus vachelli and their Hybrid

INAD (Inactivation no after-potential D)蛋白是一种典型的支架蛋白, 其核心结构由5个PDZ结构域串联组成, 定位于果蝇光感受器的微绒毛上, 负责介导G蛋白偶联级联视觉信号通路, 调控果蝇视觉信号的传导[16]。但INAD蛋白的其他功能研究非常少, 尤其是在生殖发育中的功能鲜有报道。一些研究表明, PDZ结构域蛋白在脊椎动物的性别决定和分化及配子形成过程中发挥着潜在的功能。小鼠含有PDZ结构域的SIP-1/NHERF2蛋白与SRY蛋白直接结合, 在雄性决定过程中共定位于原支持细胞的细胞核中并可能发挥一定的功能[17]。含有PDZ结构域的GOPC蛋白可与自噬相关蛋白Beclin1 (Atg6)或外周膜蛋白PICK1结合, 在精子顶体发生过程中受Atg7的调控, 而且敲除GOPC, Atg7或PICK1的小鼠由于顶体合成缺陷而无生殖能力, 表现出人类圆头精子症的表型[18—20]。在黄鳍短须石首鱼(Seriola quinqueradiata)中, 对性别决定位点连锁的BAC进行测序和连锁分析, 发现包含PDZ结构域的GIPC蛋白可能会参与该石首鱼的性别决定中[21]。基因打靶和编辑技术如TALEN和CRISPR/ Cas9的出现使在经济鱼类中进行基因功能性研究变得相对简单。阐明Inad-like在黄颡鱼性别决定中的功能或许为黄颡鱼的性染色体进化及鱼类的性别决定机制提供新的见解, 为基于性别控制的遗传育种改良提供必要的理论和技术方法。

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IDENTIFICATION OF PELTEOBAGRUS FULVIDRACO, PELTEOBAGGRUS VACHELLI AND THEIR INTERSPECIFIC HYBRID BY DNA MARKERS

GONG Gao-Rui1, ZHANG Jing1, DAN Cheng1, GUI Jian-Fang1,2and MEI Jie1
(1. Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) is an important aquacultural fish species in China. Since hydrid breeding is an efficient method to improve aquaculture products, interspecific hybrid between Pelteobagrus fulvidraco and its close species Pelteobaggrus vachelli that grows faster than Pelteobagrus fulvidraco, has been massively produced. However, it is hard to distinguish Pelteobagrus fulvidraco from the interspecific hybrid by morphological features. Moreover, the interspecific hybrid could not being used as parents for the existence of sterile hybrids. Previously, we constructed a bacterial artificial chromosome (BAC) library from YY super-male yellow catfish and screened out a BAC clone containing the sex-linked marker, Pf62-Y. In this study, we identified a novel gene inad-like in Pelteobagrus fulvidraco after sequencing the BAC clone, and the exons of inad-like are the same in X and Y chromosomes. Moreover, we cloned partial intron sequences of inad-like in Pelteobaggrus vachelli based on the exon sequences of inad-like in Pelteobagrus fulvidraco. Interestingly, there is a small segment deletion in Pelteobaggrus vachelli in comparison with the corresponding sequence in Pelteobagrus fulvidraco. Based on the significant genetic difference between Pelteobagrus fulvidraco and Pelteobaggrus vachelli sequences, we designed one pair of primers, by which 1908 bp and 1178 bp were amplified in Pelteobagrus fulvidraco and Pelteobaggrus vachelli, respectively. Moreover, both 1908 bp and 1178 bp were amplified in the interspecific hybrid. Together, this new genetic marker develops a highly stable and efficient method for distinguishing Pelteobagrus fulvidraco and its interspecific hybrid.

Pelteobagrus fulvidraco; Pelteobaggrus vachelli; Hybrid; Molecular marker; Species identification

Q173

1000-3207(2017)02-0321-05

10.7541/2017.39

2016-10-14;

2016-12-12

淡水生态与生物技术国家重点实验室自主课题(2015FB03)资助 [Supported by Fund of State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology]

巩高瑞(1994—), 男, 山东人; 硕士研究生; 主要从事鱼类遗传育种研究。E-mail: two216@qq.com

梅洁, 博士, 教授; E-mail: jmei@mail.hzau.edu.cn