高灵敏黄曲霉毒素B1免疫层析定量检测法的建立

刘 静 王树颖 刘道峰 赖卫华

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2. 江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

高灵敏黄曲霉毒素B1免疫层析定量检测法的建立

刘 静1王树颖1刘道峰2赖卫华1

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2. 江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

以胶体金为标记物，借助于胶体金读取仪，建立了高灵敏的定量检测黄曲霉毒素B1的胶体金免疫层析方法。试纸条制备时，当标记溶液pH为6.0，检测线全抗原的使用浓度为1.5 mg/mL，金标抗体浓度为4 μg/mL、用量为1.2 μL时，所建立方法的灵敏度为5.7 ng/L。通过加速保存试验，结果显示该试纸条的保存期大于1年。该试纸条应用于实际谷物及酱油加标样本检测，证明该方法可满足食品快速检测的需要。

AFB1；免疫层析；胶体金；加标回收

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌产生的次级代谢产物[1-2]。AFB1易存在于小麦、大米、花生等农作物和酱油等食品中，具有致癌性、致突变性和致畸性[3-5]。黄曲霉毒素无色、无嗅、无味，有良好的热稳定性，通常的烹饪方式以及高压灭菌都不能降解黄曲霉毒素[6]。由于AFB1对食品及饲料的污染范围较广，会危害人畜健康，所以许多国家和组织制定了食品和饲料中AFB1的最高限量标准。欧盟规定直接提供给人类食用的食物及其成分中AFB1的含量不能超过2 μg/kg，AFB1、B2、G1、G2的总量不得超过4 μg/kg；日本规定食品中AFB1的含量不能超过10 μg/kg。中国食品中AFB1允许量标准 (GB 2761—2011) 规定：玉米、花生及其制品中不得超过20 μg/kg，大米、植物油(除玉米、花生油)中不得超过10 μg/kg，其他粮食、豆类、发酵食品及婴幼儿配方食品中不得超过 5 μg/kg[7]。

AFB1主要的测定方法有高效液相色谱法[8-9]、液相色谱-质谱联用法[10-11]、酶联免疫吸附法[12-13]、免疫层析方法[14-16]等。高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法等仪器法灵敏度高、重复性好、可实现准确的定量检测，但样品前处理相对复杂，检测周期长，需要专业人员操作。酶联免疫吸附法具有灵敏度高、检测时间较短等优点，但需要专业人员操作，不能现场检测，因此限制了该方法的普及推广。以膜为固相载体的免疫层析法由于其快速、便捷的优点，越来越受到人们的重视。近年来发展迅速的胶体金试纸条检测技术，其灵敏度高、对操作人员要求低，并且不需要昂贵的仪器设备，被认为是目前最具应用价值和发展潜力的分析技术之一。大多数已报道的AFB1试纸条检测以定性检测为主[15-16]，定量检测方法研究较少。王督等[17]采用自主研制的AFB1胶体金免疫定量检测卡，建立花生、玉米、大米、小麦等粮油农产品中AFB1的定量分析方法，4种样品检测的线性范围为1.0～20.0 μg/kg，方法的定量限为 1.0 μg/kg。徐振斌等[18]立了定量检测玉米中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的胶体金免疫层析法，方法的检出限为1.0 μg/kg，定量限为3.0 μg/kg。本试验建立了AFB1的胶体金免疫层析定量检测法，且灵敏度较高，可以通过稀释来降低基质干扰，满足检测要求，有效地扩大了检测范围。

本试验拟采用免疫层析的方法，以胶体金为标记材料，通过金纳米颗粒在检测线的富集显示出颜色信号，结合胶体金信号读取仪量化信号强度，最后经计算检测线和控制线信号强度的比值(T/C值)来分析待测物的具体浓度。在优化系列参数的基础上，建立AFB1的胶体金免疫层析定量检测方法，并用于实际样本中AFB1的检测，结合较为简单的前处理方法，可有效提高筛查的效率，同时其灵敏度也符合中国对AFB1的检测标准，可用于大批量现场筛查。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

AFB1标准品：纯度≥99%，美国Sigma公司；

牛血清白蛋白(BSA)：纯度96%，美国Amresco公司；

PEG 20000: 纯度≥99%，德国Merck公司；

抗AFB1单克隆抗体、AFB1-BSA检测抗原、胶体金复溶液、30 nm胶体金：无锡中德伯尔生物技术有限公司；

驴抗鼠IgG：北京中衫金桥生物技术有限公司；

PVC黏性底板、聚酯膜、吸水纸、玻璃纤维膜：上海金标生物技术有限公司。

1.1.2 仪器

三维喷点平台：XYZ3050型，美国Bio-Dot公司；

真空干燥机：DZX-6090B型，上海福玛实验设备有限公司；

胶体金试纸条读取仪：HG-8型，上海互帼科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胶体金标记抗体 取2 mL胶体金溶液于润洗好的烧杯中，用0.2 mol/L的K2CO3调节pH，在室温下用磁力搅拌器搅拌均匀；在磁力搅拌下逐滴缓慢加入AFB1单抗，室温下搅拌反应1 h，抗体的加入体积是胶体金总体积的1/10；之后逐滴加入1%的PEG 20000进行封闭，室温下搅拌反应30 min，PEG 20000的加入体积是胶体金总体积的1/10；再逐滴加入10%的BSA进行第二步封闭，加完后搅拌反应30 min，BSA的加入量是胶体金总体积的1/10；经过8 000 r/min、4 ℃离心30 min后弃上清，沉淀用200 μL胶体金复溶液进行复溶。

1.2.2 胶体金免疫层析试纸条的组装及检测 用XYZ3050型三维喷点平台在结合垫上喷上一定量的金标抗体，将一定浓度的AFB1—BSA和驴抗鼠二抗喷在NC膜上作为检测线(T线)和质控线(C线)。胶体金免疫层析试纸条的组装过程，首先将吸水纸、上述制备的NC膜、结合垫、样本垫和聚酯纤维膜依次粘贴在PVC底板上，然后用切条机切割成3.9 mm 宽的细条并组装在塑料卡壳中。检测时，将制备好的胶体金试纸条取出，将100 μL待检样品加入到加样孔中，反应一定时间后用胶体金读取仪读取T、C线数值以及T/C比值。

(1) 胶体金标记抗体pH值：固定胶体金标记抗体量4 μg/mL，金标抗体用量1.2 μL，检测抗原浓度1.5 mg/mL，胶体金标记抗体pH值分别选取5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，将100 μL阴性样品加入到加样孔中，反应20 min后用胶体金读取仪读取T、C线数值以及T/C值，每组做3个平行。

(2) 胶体金标记抗体量：固定胶体金标记抗体pH值为 6.0，金标抗体用量1.2 μL，检测抗原浓度1.5 mg/mL，胶体金标记抗体量分别选取2，4，6，8，10 μg/mL，反应20 min后用胶体金读取仪读取T、C线数值以及T/C值，每组做3个平行。

(3) 金标抗体用量：固定胶体金标记抗体pH值为 6.0，胶体金标记抗体量4 μg/mL，检测抗原浓度1.5 mg/mL，金标抗体添加体积分别选取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 μL。反应20 min后用胶体金读取仪读取T、C线数值以及T/C值，每组做3个平行。

(4) 检测抗原浓度：固定胶体金标记抗体pH值为 6.0，金标抗体用量1.2 μL，胶体金标记抗体量4 μg/mL，检测抗原浓度分别选取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，反应20 min后用胶体金读取仪读取T、C线数值以及T/C值，每组做3个平行。

(5) 免疫动力学曲线的研究：制备胶体金免疫层析试纸条，加样后，每个试纸条每隔1.5 min读取一次T线值和C线值，根据T线值和C线值的比值数据(T/C值)，得到免疫动力学曲线。

1.2.4 AFB1定量标准曲线的建立 经LC—MS/MS确证为AFB1阴性的样品中添加AFB1标准品，制备AFB1系列标准溶液 (0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L)。取AFB1标准溶液用胶体金试纸条检测，记录试纸条T/C 值，每个浓度重复检测3次。以AFB1浓度对数为横坐标，T/C值为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.5 胶体金免疫层析方法的性能评价

对照组给予常规用药治疗,常规抗感染、吸氧和止咳等,纠正酸碱紊乱和水电解质紊乱,静脉滴注3.75g尼可刹米+500ml浓度5% 的葡萄糖溶液。

(1) 胶体金免疫层析方法灵敏度：配制不同浓度的AFB1标准溶液(0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L)。分别用胶体金免疫层析试纸条进行检测，每个浓度重复检测3次。加样20 min后用胶体金读取仪读取数值。平行试验结果取平均值后，绘制标准曲线，参考Anfossi等[19]的方法计算该层析方法的灵敏度。

(2) 胶体金免疫层析方法可重复性：配制不同浓度的AFB1标准溶液(0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L)。每个浓度做10个平行检测。

(3) 胶体金免疫层析方法稳定性：在37 ℃和60 ℃下进行加速保存试验。37 ℃时，测试的时间为：第0、7、14、28、56、105天，以及第6个月和第12个月。60 ℃时，测试的时间为：第0、1、2、3、5、7天。

1.2.6 样本前处理及加标回收试验 用不含AFB1的大米，小米样品作为空白样品进行加标回收试验，每个加标浓度同时做3组平行。首先将谷物样本研磨，过20目筛。加入AFB1标准品，使AFB1含量为5 μg/kg。然后准确称取2 g谷物样本于100 mL三角瓶中，加入30 mL 60%甲醇—水溶液对谷物中的AFB1进行萃取，充分振荡20 min。取1 mL收集好的滤液于离心管中，最后加入2 mL蒸馏水稀释。此稀释液即为待检样。用制备好的胶体金免疫层析试纸条进行检测，根据加标浓度计算出加标回收率。

从本地超市购得鲁花酱油、厨邦酱油两个品牌的酱油，经LC—MS/MS确证为AFB1阴性样品。加入AFB1标准品，使酱油样本中的AFB1含量最终为5 μg/L。用水稀释100倍，用制备好的胶体金免疫层析试纸条进行检测，根据加标浓度计算出加标回收效率。

结合绘制好的标准曲线和线性回归方程得出提取液中待检物质的浓度。

加标回收率根据式(1)计算：

(1)

式中：

R——加标回收率，%；

v1——检出浓度，μg/kg；

v2——加标浓度，μg/kg；

n——稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 胶体金免疫层析试纸条的制备及检测

由图1可知，当待测样本为阴性(0 μg/L)时，T线出现很强的红色条带，随着待测物浓度的升高，T线条带的强度越来越弱，C线条带的强度越来越强，相应的T/C值呈现一定的梯度变化，符合定量检测的要求。

从左至右，样本加标浓度依次为0.00，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μg/L

图1 胶体金免疫层析试纸条检测结果

Figure 1 Detection result of the colloidal gold immunochromatographic test strips

2.2 胶体金免疫层析法条件优化

2.2.1 胶体金标记抗体pH值的优化 由图2(a)可知，T线的信号强度随着pH的降低而增强，在pH 6.0时，T线的信号值最强，即抗体的标记效率最高，因此选取pH 6.0为最佳。这是由于随着pH的降低，蛋白表面聚集的正电荷增多，在静电吸附下能够更有效地与表面带负电的胶体金颗粒结合。但是当胶体金在pH 5.0的条件下标记抗体时出现了死金的现象。

2.2.2 胶体金标记抗体量的优化 由图2(b)可知，随着抗体标记量的增加，T/C值呈上升趋势。随着T/C值的增大，平行试验之间的变异系数也逐渐增大，意味着检测结果的可重复性降低。这可能是在抗体用量达到一定水平时，T线上呈现的信号强度达到读取仪的临界值，从而得到不准确且偏差较大的读数。因此，综合考虑节省抗体、检测结果的CV值和灵敏度，最终选取4 μg/mL为最佳抗体标记量。

图2 胶体金免疫层析法条件的优化Figure 2 Optimization of the colloidal gold immunochromatographic test strips

2.2.3 金标抗体用量的优化 由图2(c)可知，T/C值随着金标抗体用量的增加呈现先变大后减小的趋势，在金标抗体用量为1.2 μL时，T/C值较大且抗体用量较少。这可能是在金标抗体用量达到一定程度后，T线上的全抗原被结合完全，剩余的金标抗体随层析反应移动到C线上，与二抗结合，使得C线显示的信号值随金标抗体用量的增加而逐渐升高，从而导致T/C逐渐降低，因此选用1.2 μL为最佳的金标抗体用量。

2.2.4 检测抗原浓度的优化 由图2(d)可知，随着全抗原浓度的增加，试纸条的T/C值有所升高，在1.5 mg/mL之后，T/C值趋于平稳。这是由于T线上全抗原浓度越高，结合的金标抗体越多，T线上呈现的信号强度就越强，同时移动到C线上的金标抗体量就越少，C线的信号强度也越弱，两者共同导致T/C值变大。在T线抗原浓度为1.5 mg/mL时，T/C值较大，且平行试验间的变异系数(CV值)较小(5个浓度检测结果CV值分别为：9%，10%，5%，8%，11%)，所以选择1.5 mg/mL为最佳的T线抗原浓度。

2.2.5 免疫动力学曲线 在免疫层析分析中，反应时间的确定非常重要，若时间过短，抗原抗体之间的反应不完全。由图3可知，在前7 min，T/C值逐渐变大，在7～15 min时一直处于下降趋势，在15 min后T/C值趋于稳定，说明15 min后抗原抗体反应达到平衡，因此选取15 min为本试纸条的检测时间。

2.3 胶体金免疫层析方法的性能评价

2.3.1 胶体金免疫层析方法灵敏度的评价 参考Anfossi等[19]的方法，根据阴性的平均值减去3倍的标准偏差，计算出本检测方法的灵敏度为5.7 ng/L。检测方法的标准曲线见图4。线性方程为Y=-0.563 9ln (x)-0.335 3，线性范围0.02～0.20 μg/kg。

2.3.2 胶体金免疫层析方法可重复性的评价 用20%甲醇—水溶液配制了不同浓度的标准溶液，每个浓度设置10个平行对照，用制备好的试纸条检测，计算平行数据之间的CV值，评价该试纸条的可重复性，试验结果见表1。由表1可知，平行数据间的CV值均<13%，重复性较好。

2.3.3 胶体金免疫层析方法稳定性的评价 在37 ℃下保存100 d后，检测结果并没有出现明显的差别(图5)，可见该试纸条的保存期在37 ℃下不小于100 d。由图6可知，在60 ℃条件下进行高温试验，保存7 d，阴性样本的T/C值没有降低，说明该胶体金免疫层析产品在高温下具有很好的稳定性。

图3 免疫动力学曲线结果Figure 3 Optimization of immunoreaction time

图4 检测方法的标准曲线Figure 4 Standard curve of the detection method

表1 试验方法的CV值Table 1 CV of the detection method

图5 37 ℃条件下不同保存天数T/C值的变化Figure 5 Changes of T/C values after different save days under 37 ℃

图6 60 ℃条件下不同保存天数T/C值的变化Figure 6 Changes of T/C values after different save days under 60 ℃

2.4 样本的加标回收试验

应用已制备好的胶体金免疫层析试纸条进行检测，分别计算出了各个样品的加标回收效率。大米、小米的加标浓度为5 μg/kg，回收率分别为73.35%和63.28%，CV值为5.95%和7.74%，CV值均小于10%。厨邦酱油和鲁花酱油的加标浓度为5 μg/L，回收率分别为107.80%和93.06%，CV值为8.51%和8.24%，CV值均小于10%，说明本试验制备的胶体金免疫层析试纸条可用于实际样本的检测。

3 结论

小分子检测时试纸条定性分析单纯追求T线消线，而试纸条的定量检测则需要保证线性范围内T、C线颜色均不消失，且控制T/C值随着浓度的变化成梯度变化。本试验主要对用于定量检测的胶体金免疫层析试纸条的各项条件进行了优化。在最优条件下，建立了AFB1的胶体金免疫层析定量检测法，确定了该方法的灵敏度、可重复性，平衡时间等指标，并对试纸条的稳定性及保存时间做了初步评价。结果显示，在pH 6.0的条件下抗体的标记效率最高，抗体标记量为4 μg/mL，T线抗原的浓度为1.5 mg/mL，金标抗体的用量为1.2 μL时，制备的试纸条灵敏度较好(5.7 ng/L)。由于灵敏度较高，该方法可以通过高稀释倍数来降低基质干扰，有效地扩大了检测范围。免疫层析技术存在的一个比较突出的问题是它的不稳定性，对胶体金免疫层析试纸条的稳定性可进一步研究，提高其稳定性，以用于产业化大生产，得到商业化的产品。

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Development of Quantitative Sensitive Immunochromatographic Assays for Detection of Aflatoxin B1

LIU Jing1WANGShu-ying1LIUDao-feng2LAIWei-hua1

(1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330047,China;2.JiangxiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang,Jiangxi330029,China)

The aim of this work was to establish a highly sensitive quantitative colloidal gold immunochromatographic assay with a test strip reader for the detection of aflatoxin B1using colloidal gold as label. When the labeling pH was 6.0, the concentration of antigen on T-line was 1.5 mg/mL, the concentration of antibody labeled on the colloidal gold was 4 μg/mL, and the dosage of gold-labeled antibody was 1.2 μL, the sensitivity of the assay was 5.7 ng/L. The results of accelerated aging experiment indicated that the strips shelf time was more than a year. It was proved that this method can meet the needs of the rapid detection of food when the strip was applied to detect cereals and soybean sauce.

AFB1; immunochromatographic assay; colloidal gold; recovery rate

江西省主要学科学术和技术带头人培养计划项目(编号：20113BCB22007)；江西省教育厅落地项目(编号：KJLD13009)

刘静，女，南昌大学在读硕士研究生。

赖卫华(1968-)，男，南昌大学教授，博士生导师。 E-mail:talktolaiwh@163.com

2016-12-09

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.011