披碱草×野大麦F1代愈伤组织诱导研究

赵 青，李造哲,*，马青枝，李 鹏，王文学，云玲格

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010019；3.内蒙古农业大学沙漠治理学院，内蒙古呼和浩特 010019)

披碱草×野大麦F1代愈伤组织诱导研究

赵 青1，李造哲1,*，马青枝2，李 鹏3，王文学1，云玲格1

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010019；3.内蒙古农业大学沙漠治理学院，内蒙古呼和浩特 010019)

以披碱草×野大麦杂种F1幼穗为外植体，设置不同的激素浓度，获得适宜的诱导培养基，并选用长度不同的幼穗为外植体，确定出较为合适的外植体长度。愈伤组织经过多次继代后，细胞生长缓慢，通过更换培养基使其恢复生长。实验结果表明，最适培养条件为：以长为2-3cm幼穗为外植体，MS + 3mg/L2,4-D为诱导培养基。MS+2,4-D 3mg/L +KT 0.5mg/L+CH 300mg/L与MS+2,4-D 4mg/L均可改善经过长期继代生长质量较差的愈伤组织的生长情况。

披碱草；野大麦；杂种F1；幼穗；愈伤组织

披碱草(Elymusdahuricus)抗寒能力强，草产量、种子产量均较高。野大麦(Hordeumbrevisubulatum)叶量丰富且草质柔软，具有分蘖能力强、返青早、再生性强、抗病虫害、耐盐碱等特性〔1-4〕。王照兰等将披碱草与野大麦进行杂交，产生杂种优势，同时具备了双亲所具有的优良特性。在杂交后的F1代，生长期延长，叶量增加，分蘖增多，穗型发生了一定的改变，显示出了一定的育种潜力。但杂种F1代高度不育，开放授粉不结实，又限制了其生态价值以及经济价值的进一步利用〔5〕。本实验通过设置不同的激素配比，通过不同的激素组合，找到较为理想的愈伤组织诱导培养基，并选取不同长度幼穗作为外植体，观察愈伤组织的生长变化，通过实验确定出适宜诱导愈伤组织的外植体长度，将适宜的培养基与合适的外植体长度相结合，以达到提高出愈率的目的。多次继代后，愈伤组织活力明显下降，增值缓慢，质量下降。本实验通过改变继代培养基的激素配比，以期改善愈伤组织的生长情况。

1 愈伤组织的诱导

1.1 材料与方法

1.1.1 实验材料

实验材料为加拿大披碱草×野大麦杂种F1幼穗。

1.1.2 培养条件

在温度为25±1℃的条件下暗培养，相对湿度为75%。

1.1.3 基本培养基对愈伤组织诱导的影响

在披碱草×野大麦杂种F1处于孕穗期时，选取长度为1-3cm的幼穗，放入塑封袋内保存带回实验室。在超净工作台中将保留一层幼叶的外植体放入烧杯中备用。剥去幼叶，用70%的乙醇消毒一分钟，并用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%的HgCl2消毒2-4分钟，再用无菌水冲洗5次。将幼穗切成长度为3mm左右的小段，接种到培养基上。每个组合12瓶，每瓶接种5段。培养基激素配比为MS+2,4-D(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L)+KT(0mg/L、0.5mg/L)，3%蔗糖，琼脂粉7g/L，pH=5.8。

1.1.4 幼穗长度对愈伤组织诱导的影响

选取不同长度的幼穗并按照0.5-1cm、1-2cm、2-3cm、3-4cm、4-5cm进行分类。在超净工作台中对外植体进行消毒处理，方法同上所述，并将幼穗切成3mm左右的小段接入培养基中，每瓶5段，每个处理12瓶。培养基配比为：MS+2,4-D3.0mg/L，3%蔗糖，琼脂粉7g/L，pH=5.8。

1.1.5 结果观测与统计方法

记录其生长情况，经过25天左右统计其出愈率，并进行继代培养，出愈率统计有关计算公式如下：

出愈率=(愈伤组织块数/接种外植体总块数)×100%

2 愈伤组织继代培养基优化研究

经过多次继代的愈伤组织生长速度缓慢，内含物质减少且有水渍状非胚性愈伤组织出现，通过改变培养基的激素配比，使其内含物质增加，愈伤组织恢复淡黄色、颗粒状、结构致密、结合疏松的健康状态。本次实验所用材料为2015年5月中下旬所采集披碱草×野大麦杂种F1幼穗为外植体诱导的愈伤组织，但经过长时间的继代培养之后，体积增长慢，质量较差。基于该实验背景下，本实验通过更改实验激素种类和浓度，以达到恢复愈伤组织的目的。选取生长状况以及大小相近或相似的愈伤组织作为基本材料，切成5mm大小放入培养基中培养，每瓶放5块。每个处理重复12瓶。共设计四种培养基，I：MS+2,4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L。II：MS+2,4-D 3.0mg/L+KT 0.1mg/L+CH 400mg/L。III：MS+2,4-D 4.0mg/L。IV：MS+2,4-D 5.0mg/L，pH=5.8，蔗糖30g/L，琼脂粉7g/L。

3 结果与分析

3.1 基本培养基对愈伤组织诱导的影响

披碱草×野大麦杂种F1幼穗在含有不同激素浓度的培养基中诱导愈伤组织，进行暗培养3天后外植体开始变白，6天后在切口处出现极少量的乳白色的愈伤组织，15天后微量的乳白色愈伤组织开始产生较为明显的增殖，25天左右愈伤组织体积增大，表面干燥。在不同激素浓度配比下，F1代幼穗均能成功诱导出愈伤组织，但愈伤组织的生长速度、生长质量不同(表1)。在只含有激素2,4-D的条件下，当2,4-D浓度为1.0mg/L、2.0mg/L时，愈伤组织增殖缓慢，出愈时间稍长，体积较小。在2,4-D浓度为3.0mg/L的情况下，愈伤组织的诱导率最高，且生长质量较好(图1-A)。当2,4-D浓度大于3mg/L时，愈伤组织的出愈率随着激素浓度的增加而下降，可见高浓度的2,4-D不利于愈伤组织的形成。当KT浓度均为0.5mg/L时，随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织的诱导率逐渐增加，2,4-D浓度为3mg/L时，愈伤组织的诱导率达到最大，为20%，之后随着2,4-D浓度的增加诱导率下降。同只含有2,4-D一种激素相比，添加KT后愈伤组织的诱导率均低于只含有同浓度2,4-D一种激素的诱导率。从总体的愈伤组织生长状况来看，添加激动素KT后愈伤组织出现了褐化现象(图1-B)，不含有激动素KT的条件下，愈伤组织生长情况更好。在2,4-D为5mg/L，KT为0.5mg/L的激素组合下，褐化最为严重。可见，在F1代愈伤组织的诱导中，生长激素2,4-D起到了关键作用，而激动素KT不适合添加在诱导培养基中。

3.2 幼穗长度对愈伤组织诱导的影响

不同长度的幼穗均可以诱导出愈伤组织(表2)。长度为0.5-1.0cm的外植体诱导出的愈伤组织生长慢，体积较小。2-3cm、3-4cm长的幼穗出愈率总体差异不大，2-3cm长的幼穗诱导率略高，质量稍好(图1-C)，之后随着外植体长度的增加愈伤组织的出愈率降低。长度在4cm以内的外植体，在培养3-5天后开始变白，随后在切口处出现微量愈伤组织，随着培养天数的增加，表面开始变干燥，愈伤组织的体积不断增大。长度在4cm以上的外植体，培养3天左右外植体开始膨大，变黄，变硬。七天左右在外植体表面产生乳白色、团状的愈伤组织并不断增大，随着培养时间的增加，颜色由开始的乳白色逐渐变为淡黄色、颗粒状的愈伤组织。

3.3 愈伤组织继代培养基优化研究

经过多次继代的愈伤组织质量下降，生长缓慢，通过更换培养基后，愈伤组织的生长情况有所改善。在不同的激素组合培养条件下，愈伤组织的生长情况不同(表3)。在I号培养基中，降低2,4-D的浓度，添加了分裂素6-BA，出现了褐化现象，增长缓慢。II号和III号培养基中的愈伤组织，均有不同程度的增加。2,4-D浓度为3.0mg/L并添加0.1mg/L的KT以及300mg/L的CH，愈伤组织的生长速度提高，生长情况较好、表面干燥，颜色为淡黄色，结构疏松，适当的添加激素以及蛋白质类物质可以提高其生长质量。当2,4-D含量为4mg/L，其生长速度明显提高，质量较好，生长量大(图1-D)。IV号培养基中，当2,4-D含量为5mg/L时，愈伤组织的生长速度未见明显提高，且出现褐化现象。实验结果表明适当的加大激素浓度有利于愈伤组织的生长，但过量的激素，反而会抑制愈伤组织的生长，引起褐化，不利于其分裂增殖。

表1 不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响

A：只含2,4-D诱导愈伤组织 B：添加KT诱导愈伤组织

C：幼穗长为2-3cm诱导愈伤组织 D：转换培养基后愈伤组织

A:Only add the 2,4-D induced callus B:Add the KT induced callus

C：Young spikes length of callus induced by 2-3 cm D：the callus after change the culture medium

图1 愈伤组织诱导

Fig.1 Callus Induction

表2 不同外植体长度对愈伤组织诱导的影响

表3 不同激素种类及浓度对愈伤组织生长的影响

4 讨论

4.1 愈伤组织的诱导

不同的植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响是不同的〔6〕，激素种类以及浓度大小对愈伤组织的出愈率的高低起到了关键作用。添加激动素KT出愈率低于只添加激素2,4-D，KT表现出一定的抑制作用，2,4-D在愈伤组织的诱导中起主导作用。这一实验结果在加拿大披碱草×肥披碱草杂种F1幼穗〔7〕、基因型和2,4-D浓度对小麦外植体离体培养〔8〕、羊草与灰色赖草杂种F1〔9〕以及披碱草×野大麦杂种F1幼穗培养再生体系的建立〔10〕、加拿大披碱草与2种国产披碱草杂种F1愈伤组织诱导〔11〕中所得出的结果相一致。外植体的长度对愈伤组织的诱导有直接影响，本实验中2-3cm的幼穗外植体的出愈率高于其他长度且生长情况最优。刘香利〔12〕、王秀红〔13〕认为长度为0.5-1.0cm的幼穗适合作为外植体诱导愈伤组织，而张小红〔14〕认为1.0-1.5cm的幼穗作为外植体有利于诱导愈伤组织，云岚认为1-2cm的新生幼穗作为诱导愈伤组织的外植体最为理想〔15〕。这可能是因为不同基因型、不同材料以及不同的生长条件、培养条件对激素的适应、需求不同，所以导致其生长情况也不相同。

4.2 激素对愈伤组织的影响

长期继代的愈伤组织生长质量下降，在增大生长激素2,4-D的含量或者添加激动素KT和水解酪蛋白后，细胞的生长情况有所恢复，通过更换培养基使愈伤组织的生长情况得到改善。可能是由于长期继代后的愈伤组织内细胞渗透压发生改变，生长激素水平下降，外源激素的增加对愈伤组织生长起到了促进作用，通过转换培养基有利于愈伤组织胚性的保持〔16〕，但愈伤组织分化情况以及能否形成再生小植株还需要后续的实验研究。

5 结论：

(1)披碱草×野大麦杂种F1幼穗为外植体诱导愈伤组织，3mg/L的2,4-D更有利于F1代愈伤组织的诱导，长度为2-3cm的幼穗更适合作为外植体来诱导愈伤组织。

(2)MS+3mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+300mg/LCH与MS+4mg/L2,4-D两种培养基都可以使质量下降的愈伤组织恢复活力，从愈伤组织外在形态来看前者更优，但后者的生长速度更快。

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Study on Callus Induction ofElymusdahuricus×HordeumbrevisubulatumF1

Zhao Qing1,Li Zaozhe1,*,Ma Qingzhi2,Li Peng3,Wang Wenxue1,Yun Lingge1

(1.College of grassland, resources and Environment ,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China;2.College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China; 3.College of desert control, Inner Mongolina Agricultural University,Hohhot 010019,China)

Young spikes ofElymusdahuricus×HordeumbrevisubulatumF1 were used as explants ,by sett the different hormone concentration ,to obtain suitable induction medium ,andthe young spikes with different length were used as the explants to determine the suitable explants length. After long-term culture of a callus, the cell growth is slow, through the replacement of the medium to restore growth.The experimental results show that with MS as the basic culture medium, add 3 mg/L 2, 4-D is better callus induction medium, induction rate of 28.3%;The length of 2-3cm young spike is more suitable for the length of explants, induction rate of 31.6%;MS + 2,4-D 3mg / L + KT 0.5mg / L + CH 300mg / L and MS + 2,4-D 4mg / L could improve the growth of long-term callus with poor growth quality.

Elymusdahuricus；Hordeumbrevisubulatum；Inter genera hybrids F1 ；Young spike ；Callus

Q943.1

A

2095—5952(2017)01—0018—06

2016-01-10

国家自然基金项目(31260575)

赵 青(1992-)，女，内蒙古乌兰察布市人，硕士研究生，主要从事植物资源保护与利用研究。E-mail：2260081244@qq.com

[*通讯作者]李造哲，男，教授，研究方向：植物资源保护与利用，E-mail：zaozheli@hotmail.com