“红颜”草莓叶片愈伤组织诱导技术研究

王 霞，王冯娟，谢晓丹

（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 132101）

“红颜”草莓叶片愈伤组织诱导技术研究

王 霞，王冯娟，谢晓丹

（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 132101）

以“红颜”草莓嫩叶为外植体，研究植物生长调节剂、pH、蔗糖浓度和光照强度对愈伤组织诱导的影响。结果表明，“红颜”草莓叶片愈伤组织很容易褐化，经20%维生素C（Vc）溶液浸泡20 min可显著降低褐化率，提高出愈率，愈伤组织诱导的最适植物生长调节剂组合为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，培养基最佳pH 6.0，蔗糖浓度3.0%，光照强度2 000Lx，此时愈伤组织生长旺盛、呈淡黄色、质地疏松，出愈率为95.0%。

“红颜”草莓；叶片；愈伤组织；诱导

“红颜”草莓（Benihoppe Strawberry）又称日本99、红颊，是日本静冈县用章姬与幸香杂交培育成的早熟草莓新品种，其生长势强，果实大，颜色鲜艳，香味浓郁，甜度高，硬度大，耐储运，深受广大消费者喜爱，现已成为我国主要的日系草莓栽培品种[1]。

目前，草莓主要采用匍匐茎分株法进行繁殖，该法繁殖周期长，极易因感染病毒而使品种退化[2]。利用组培技术繁育草莓苗周期短、繁殖系数高、成本低，同时不受季节、气候等外界因素的影响，具有实现工厂化生产的巨大潜力。愈伤组织的成功诱导是组培快繁技术的关键步骤，目前报道的“红颜”草莓叶片愈伤组织的诱导均是用噻重氮苯基脲（TDZ）作为细胞分裂素[3]，但TDZ价格昂贵，并不利于工业化生产。试验首次采用性价比较高的植物生长调节剂6-BA和NAA，研究其不同水平的组合以及pH、蔗糖浓度、光照强度对草莓叶片愈伤组织诱导的影响，为“红颜”草莓的快速繁殖和品种推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及预处理

“红颜”草莓，采自于吉林省吉林市孤店子镇大荒地村神农庄园。

取未展开草莓幼叶先后用75%酒精和0.1%升汞按照常规灭菌方法进行处理，并切成约0.5 cm×0.5 cm小块，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 不同6-BA和NAA浓度组合的筛选 将叶片接种于含有不同6-BA和NAA浓度组合的MS培养基中（见表1），每瓶接种1个外植体，50d后统计出愈率；为防止褐化，将叶片用20%Vc溶液浸泡20 min，然后按照上述方法重新接种。培养基蔗糖浓度30 g/L，琼脂浓度7 g/L，pH 5.8，培养条件：温度25℃，光照周期16 h/d，光照强度2 500

Lx，设置重复30次。

1.2.2 pH的筛选 叶片用20%Vc溶液浸泡20 min，接种于含有最佳6-BA和NAA浓度组合的MS培养基中，培养基pH设5.4、5.6、5.8、6.0和6.2 5个梯度，蔗糖与琼脂浓度、培养条件、重复次数和培养时间同1.2.1，筛选最佳培养基pH。

1.2.3 蔗糖浓度的筛选 叶片用20%Vc溶液浸泡20 min，接种于MS培养基中，培养基蔗糖浓度设1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%5个梯度，6-BA和NAA浓度组合、pH分别为上述筛选的最佳值，其余操作、琼脂浓度、培养条件、重复次数和培养时间同1.2.1，筛选最佳培养基蔗糖浓度。

1.2.4 光照强度的筛选 叶片用20%Vc溶液浸泡20 min，接种于MS培养基中，6-BA和NAA浓度组合、pH、蔗糖浓度分别为上述筛选的最佳值，光照强度设1 000、1 500、2 000、2 500、3 000Lx 6个梯度，其余操作、琼脂浓度、培养温度、光照周期、重复次数和培养时间同1.2.1，筛选最佳光照强度。

1.3 统计方法

出愈率（%）=诱导愈伤组织的叶片数/接种叶片数×100.0%；

褐化率（%）=褐化的外植体数/接种的叶片数×100.0%[4]。

2 结果与分析

2.1 不同6-BA和NAA浓度组合对草莓叶片愈伤组织诱导的影响

“红颜”草莓幼叶在含有不同6-BA和NAA浓度组合的MS培养基中培养50 d，出愈率均比较低，最高只有70%，而且所有处理均出现了不同程度地褐化现象，褐化率最高可达90%。为避免或降低褐化率，实验采用20%Vc溶液浸泡叶片20min，结果发现9个处理的褐化率都明显降低，出愈率都显著升高。处理1在未经Vc溶液处理时几乎不能诱导愈伤组织，外植体褐化严重（图1a），经Vc溶液处理后，出愈率是处理前的2.20倍，褐化率降为处理前的70%；处理5出愈率最高，未经Vc溶液处理的愈伤组织有一小部分褐化（图1b），Vc溶液处理后褐化率明显下降，培养25d左右可见多个较大的乳白色愈伤组织球（图1c），50d左右愈伤组织生长旺盛，覆盖所有叶片，呈淡黄色（图1d）。综上得出，草莓叶片愈伤组织诱导的最佳生长调节剂组合是6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/ L。

图1 部分草莓叶片愈伤组织诱导图

2.2 pH对草莓叶片愈伤组织诱导的影响 见图2。

图2 pH对草莓叶片出愈率的影响

由图2可知草莓叶片出愈率随pH升高呈先增后降趋势，当pH为5.4时，培养基不能完全凝固，出愈率较低；pH为6.0时，出愈率最高可达93.0%，且愈伤组织生长良好；当pH为6.2时，叶片出愈率较低[5]。综上得出，草莓叶片愈伤组织诱导培养基最佳pH6.0。

2.3 蔗糖浓度对草莓叶片愈伤组织诱导的影响见图3。

图3 蔗糖浓度对草莓叶片出愈率的影响到

由图3可知草莓叶片出愈率随蔗糖浓度升高呈先增后降趋势，蔗糖浓度为1.0%时，叶片出愈率较低为20%，随着蔗糖浓度增加，出愈率逐渐增加，当蔗糖浓度为3.0%时，出愈率达最高值93%，之后出愈率开始降低，因此草莓叶片愈伤组织诱导的最佳蔗糖浓度为3.0%。

2.4 光照强度对草莓叶片愈伤组织诱导的影响见图4。

图4 光照强度对草莓叶片出愈率的影响

由图4可知草莓叶片出愈率随光照强度增加呈先增后降趋势，光照强度为1 000Lx时，叶片出愈率最低为30%，光照强度增加到2 000Lx时，叶片出愈率最高为95%，之后随光照强度增加，叶片外缘开始变黄变褐，出愈率逐渐降低，因此，草莓叶片愈伤组织诱导的最佳光照强度为2 000Lx。

3 讨论

“红颜”草莓叶片在含有最佳6-BA和NAA浓度组合的MS培养基上培养16d左右长出肉眼可见的愈伤组织，此时褐化率很低，但随培养时间的延长，褐化逐渐严重，结果与付崇毅等[6]研究的草莓茎尖褐化程度一致。Vc作为防褐化最常用的抗氧化剂之一，多配制成溶液添加到培养基中[7]。但由于Vc遇热易分解，因此需要过滤除菌后再添加到灭菌培养基中，使操作过程繁琐，同时增加了污染的几率，故实验采用较高浓度Vc溶液浸泡草莓叶片来抑制褐化，取得了较理想的实验结果，不仅降低了褐化率，还提高了出愈率。

植物生长调节剂是影响外植体出愈率的关键因素，实验发现，诱导“红颜”草莓叶片愈伤组织的最佳浓度组合是6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L，与“甜查理”草莓叶片愈伤组织诱导的最佳浓度组合6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L相似[8]。

pH大小、蔗糖浓度和光照强度也是影响外植体愈伤组织诱导的重要因素。一定范围内，pH大小与培养基的凝固性成正比，因此pH过大过小，都不利于外植体对培养基本成分的吸收和利用[5]，而蔗糖作为外植体生长的的碳源和能源，其浓度大小不仅影响出愈率，还会影响愈伤组织的质地和结构。光照是外植体愈伤组织诱导所必需的，光照强度直接影响愈伤组织的生长情况，光照强度过小，会降低外植体生理活力，光照强度过大，容易使酚类等物质氧化，增加褐化率[9]。实验发现，“红颜”草莓叶片愈伤组织诱导培养基最佳pH6.0，高于珂字棉312愈伤组织诱导的最佳pH5.8[10]；最佳蔗糖浓度为3.0%，与油茶愈伤组织诱导最佳蔗糖浓度一致[11]；最佳光照强度为2000Lx，高于对高山红景天愈伤组织诱导的光照强度1000Lx[12]。

[1]晁慧娟，刘 敏，姬谦龙，等.“红颜”草莓茎尖培养与快速繁殖[J].北京农学院学报，2009，24（4）：14-16.

[2]孙艳平，庞兴城，韩金伟.脱病毒草莓高产优质栽培技术[J].现代农业，2011（6）：20.

[3]董 莉，晁慧娟，董清华，等.“红颜”草莓叶片再生体系的建立[J].中国农学通报，2010，26（10）：246-249.

[4]韦 莹，黄宝优，缪剑华，等.剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导技术研究[J].种子，2016，35（8）：80-82.

[5]王 泉，孙珮石，王树坤，等.酸性固体培养基中琼脂凝固性影响因素的初探[J].环保科技，2008（2）：8-9.

[6]付崇毅，姜 伟，王建国，等.草莓茎尖组织培养防褐化及玻璃化研究[J].北方农业报，2016，44（1）：46-51.

[7]张 智，邵菊芳，滕婷婷，等.抗氧化剂对银杏愈伤组织褐变的影响[J].安徽农业科学，2008，36（30）：13051-13052.

[8]晁慧娟，董 莉，姬谦龙，等.“查理”草莓叶片再生体系的建立[J].北京农学院学报，2009，24（4）：11-13.

[9]谷延泽，高瑞彦.植物组织培养中的褐化现象及防治措施[J].河北农业科学，2008，12（6）：56-58.

[10]邹 甜，郑顺利，匡 琛，等.珂字棉312组织培养体系的建立[J].棉花科学，2016，38（4）：3-7.

[11]王 瑞，陈永忠，王湘南，等.碳源及蔗糖浓度对油茶愈伤组织诱导的影响[J].西南农业学报，2013，26（1）：223-225.

[12]李金凤，崔 苗，刘宪虎，等.光温条件对高山红景天愈伤组织诱导及生长的影响[J].北方园艺，2012（11）：185-187.

责任编辑：建德锋

Study on the Callus Induction Technology of Benihoppe Strawberry Leaves

WANG Xia,WANG Fengjuan,XIE Xiaodan
（Jilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering,Jilin 132101）

The effects of plant growth regulators,pH,sucrose concentration and light intensity on the induction of the callus were studied by using leaves of Benihoppe strawberry as explants.The results showed that the inducing callus was easy to brown,and the browning rate was decrease and the callus induction rate was increase when the explant was soaked in the 20%Vc solution for 20 minutes.6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L, pH6.0,sucrose concentration 3.0%were the best medium condictions,and the optimal light intensity was 2 000 Lx.The callus was loose,pale yellow and grew vigorously while the induction rate was 95.0%in the best condictions.

Benihoppe Strawberry；leaf；callus；induction

S668.4

A

2016-11-12

王 霞（1978-），女，江苏省连云港市人，讲师，研究方向：植物分子生物学。