鲤鱼骨明胶提取工艺优化及性质研究

高倩倩

（吉林农业科技学院文理学院，吉林 132101）

鲤鱼骨明胶提取工艺优化及性质研究

高倩倩

（吉林农业科技学院文理学院，吉林 132101）

以鲤鱼骨作为原料,对其进行明胶提取工艺研究，通过采用不同的单因素设计及正交试验，确定其提取最佳工艺条件。结果得出：对鲤鱼骨明胶得率产生影响的单因素分别为酸处理用时、提取温度、提取用时、料液比；同时表明：用硫酸浸泡鲤鱼骨的时间为7 h，提取温度为40℃，提取时间为7 h，料液比为1：6（g/mL)，此工艺条件下，明胶得率为87.1%。鲤鱼骨明胶SDS-PAGE电泳可见两条清晰条带，蛋白相对分子质量为12.9 KDa和11.8 KDa，即构成骨明胶组分为α1和α2，紫外光谱分析明胶纯度较高。

鲤鱼骨；明胶；得率；研究

明胶广泛应用于食品、医药、化妆品等领域的原因是因它具有特有的理化性质及生物相容性[1-2]。哺乳动物（如牛、猪、羊等等）的骨头和皮是制备明胶的主要原材料。随着环境的变化，明胶原料易受细菌的侵害，制备明胶的传统原料地位受到了动摇[3-4]。从而使水产品原料应运而生，由于其更具安全性，对水产品副产物的利用率更具高值化[5]（如鱼骨等），因此市场前景更为广阔。

鲤鱼骨作为鱼类产品的下脚料最普遍的处理方法是废弃，仅有一小部分用于生产小食品或低值鱼粉[6-7]，造成资源浪费和环境污染。有效合理地利用鲤鱼下脚料，可以降低生产成本，提高经济价值，是鲤鱼加工行业有待解决的问题[8]。本试验的目的是以鲤鱼骨为原料提取明胶，可以增加产品的附加值，减少资源的浪费。通过凝胶电泳成像验证蛋白[9]，确定鲤鱼骨中明胶存在，从而得到明胶的最大得率，紫外光谱分析判断明胶的纯度。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料试剂 鲤鱼骨；石油醚、EDTA、四甲基乙二胺、过硫酸铵、甘油、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、SDS、三羟甲基氨基甲烷、Tris-Hcl、TEMED、考马斯亮蓝R-250。

1.1.2 试验仪器 电泳仪、电热恒温鼓风干燥箱、匀浆机、旋转蒸发仪、水浴锅、离心机、冷冻干燥机、紫外分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 基本成分测定 水分、灰分、脂肪、蛋白质、羟脯氨酸含量均按国标方法测定。

1.2.2 鲤鱼骨明胶的提取 （1）工艺流程：新鲜鲤鱼骨→清洗、去除杂质→脱脂（石油醚回流脱脂）→硫酸浸泡→称量→加水→匀浆提胶→离心→浓缩→冷冻干燥→称量→明胶样品。（2）操作步骤：将鲤鱼骨洗净，清除骨头上的鱼肉等杂质，100℃干燥，研钵研成粉末。用托盘天平准确称取鲤鱼骨粉20 g，以石油醚作溶剂，索氏提取1.5 h，在经过蒸馏浓缩、进一步升华脱脂[10]，再浸入到H2SO4溶液中，并调节溶液的pH值为3.5～4.5，浸泡时间4～8h最好。当鲤鱼骨浸泡至发软时捞出洗净，称量。向称重后的鲤鱼骨中加水，匀浆（T= 55℃，t=5.5 h）后按照试验条件进行提取，离心（4000转，10 min)，旋转蒸发（T=60℃，旋转12 min)，得到浓缩液，冷冻干燥（-70℃，3-4d），得到明胶样品，称重。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：①配制溶液：A液-丙烯酰胺储存液；B液-分离胶缓冲液；C液-堆积胶缓冲溶液；10%过硫酸铵；电泳缓冲液；TEMED；考马斯亮蓝染液；考马斯亮蓝脱色液；上样缓冲液。②样品处理：分别取鱼骨提胶样品1，2，3，4，5号20 uL，加入离心管中，分别加入上样缓冲液5 uL，充分混合均匀，水浴加热（T=100℃，t=5 min），取出并放于室温。③上样：将上述样品通过微量注射器导入样品孔中，上样时间1.5 h，逐渐升高注射器针头，避免带入气泡。④考马斯亮蓝染色：将上样液用考马斯亮蓝染色液染色，放到摇床上染色0.5 h。⑤脱色∶用考马斯亮蓝脱色液脱色3～4 h，每2 h换一次脱色液。⑥照相，确定蛋白分子量。（4）明胶得率计算：D/%=A/B×100%；式中：D为明胶得率；A为明胶质量（g)；B为原料鱼骨质量（g)。（5）单因素试验：通过预试验可以得到，酸处理时间、提取温度、提取时间、提胶料液比是鲤鱼骨明胶得率的最大影响因素。在此基础上设计单因素试验，各因素梯度分别为：酸处理时间为4、5、6、7、8 h；提取温度10、20、30、40、50℃；提取时间4、5、6、7、8 h；提胶料液比1：2、1：4、1：6、1：8、1：10（g/mL)，重复试验3次。（6）正交试验设计：分析单因素试验中4个因素的影响。确定水平取值范围，设计L9（34）正交试验。（7）紫外光谱分析：将提取得到的明胶样品置于烧杯中，加入0.8 mol/L冰乙酸溶液，使其溶解，配制成1 mg/mL的明胶溶液，在200～400 nm处使用UV-2102PC紫外分光光度计进行扫描。

2 结果与分析

表1 鲤鱼骨基本组成成分

2.2 鲤鱼骨明胶提取单因素试验

图1 硫酸处理时间对明胶得率的影响

2.2.1 硫酸处理时间对明胶得率的影响 见图1。由图1可知，当酸处理时间小于7 h时，明胶得率上升显著，酸处理时间在7 h时，明胶得率最高，还可降低时间上的成本；当酸处理时间进一步提高时，得率变化不明显。

2.2.2 提取温度对明胶得率的影响 见图2。

图2 提取温度对明胶得率的影响

由图2可知，明胶得率与温度相关，温度低于40℃时，提胶样品溶液较稀薄，胶少，温度达到40℃时明胶得率最高，如果超过40℃，高温下明胶会发生水解，明胶得率下降。

2.2.3 提取时间对明胶得率的影响 见图3。

图3 提取时间对明胶得率的影响

2.1 基本成分测定见表1。

由图3可知，明胶得率随时间增加而增加，时间达到7 h时有着较高的明胶得率。当t增加时，明胶得率变化不明显。由于热水抽提时间过短，导致明胶无法充分提取出来，得率太低；如果用时过长，明胶会过度水解。所以提取时间为7 h最好。

2.2.4 提胶料液比对明胶得率的影响 见图4。

图4 料液比对明胶得率的影响

由图4可知，提胶料液比1：6 g/mL时明胶得率最高，如提胶料液比低于1：6 g/mL时，明胶得率趋于平稳，基本上没有太大变化。而不断增加料液比会增加上述操作工作量，所以，提胶料液比选为1：6 g/mL比较适宜。

2.3 鲤鱼骨明胶提取的正交优化试验

2.3.1 正交试验设计的因素与水平

以单因素试验为基础设计正交试验，选用L9（34)正交试验因素水平表（见表2），确定鲤鱼骨明胶提取的最佳工艺条件。

表2 正交试验的因素水平设计

2.3.2 正交试验结果 见表3。

由表3中R值可以看出，各因素对明胶得率的影响由大到小的顺序为酸处理时间、料液比、提取时间、提取温度。因此，酸处理时间影响明胶得率的程度最为显著。通过分析明胶得率最佳组合为A2B1C3D3，可以得出，提取鲤鱼骨明胶时用硫酸处理时间为7 h，提取温度为40℃，提取时间为7 h，料液比为1：6（g/mL)，在此工艺条件下，明胶得率为87.1%。

表3 正交试验结果与分析

2.4 鲤鱼骨胶原SDS-PAGE凝胶电泳---电泳成像

鲤鱼骨明胶相对分子质量如图5。由图5可见，明胶有明显的两条电泳条带在130 000和97 400之间，相对分子质量分别为12.9KDa和11.8KDa。胶原α中分别显示α1与α2，就是蛋白电泳形成的。而接近97 000这个量，它是胶原相对分子质量，是由标准蛋白构成的。从电泳中可以看到，下图显示的相对分子质量要比标准蛋白胶原的α链大很多，鲤鱼骨明胶结构是有分支的，它构成胶原α组分完全是由完整的构成胶原α链上的共价交联一些小肽片段构成。骨胶原转化为明胶的过程中，之所以导致明胶分子非均一性，主要是因为断裂的共价交联键、肽键、次级键之间无规则排列造成的。

图5 鲤鱼骨明胶的电泳图

2.5 明胶的紫外光谱分析 见图6。

图6 鲤鱼骨明胶的紫外光谱吸收

蛋白质分子中含有能在紫外波长光范围内产生吸收的基团，一般称为生色团或发色团货色基。各种紫外生色基团的加和会促使蛋白质溶液在紫外区存在吸收。由图6可见，鲤鱼骨明胶最大吸收波长在约235 nm处，明胶的特征吸收峰与之对应，主要是由有机化合物明胶的n→π*和n→σ*价电子能级跃迁所产生。在280 nm处吸收较少，说明样品只含有少量芳香族氨基酸，所提取的明胶纯度较高。

3 结论

明胶作为重要的食品添加剂的原因是它具有较好的胶黏、高度分散、特低粘度、分散稳定、持水、韧性、被覆性及可逆性等物理性质。

本试验主要是以鲤鱼骨作为试验原料提取明胶。以单因素试验为基础，采用正交试验确定鲤鱼骨提取明胶最佳条件，酸处理用时对明胶得率的影响最为显著。通过正交试验结果中的极差R可以得出明胶得率最佳组合为A2B1C3D3，即鲤鱼骨明胶提取时用硫酸处理7 h，提取温度为40℃，提取时间为7 h，料液比为1：6（g/mL)，在此优化条件下，明胶得率为87.1%。各因素对明胶得率的影响顺序为酸处理时间、料液比、提取时间、提取温度。

鲤鱼骨明胶SDS-PAGE电泳可见两条清晰条带，蛋白相对分子质量为12.9 KD和11.8KD，即构成骨明胶组分为α1和α2，有明胶存在。紫外吸收光谱测定结果表明，明胶在235 nm处有最大吸收，在280 nm处吸收较少，其纯度较高。因此，可应用于食品药品的开发与利用上，为人类提供更好的资源。而且鲤鱼骨作为加工之后的下脚料并未充分利用，多用于当饲料或肥料，现在将其进行高效综合利用，可提高鲤鱼加工的附加值，获得良好的经济和社会效益。

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责任编辑：建德锋

Study on the Extraction and Property of Gelatin from Carp Bone

GAO Qianqian
（Jilin Agricultural Science and Technology Unversity School of Arts and Sciences,Jilin 132101）

In the study,took carp bone as the material and tried to generalize its gelatin extraction technology.Single factor experiment was adopted,through orthogonal experiment to determine the best technical condition.The effect of sulfuric acid treatment time,extraction temperature,extraction time,gelatin liquid ratio was studied on the yielding rate of carp bone gelatin.the results showed that the optimal extraction technology for carp bone gelatin was 1.2%sulfuric acid for 7 h,extracting material liquid proportion being 1∶6 (g/ml),extraction temperature 40℃.In this process conditions,the yield was 87.1%.Carp bone gelatin SDSPAGE electrophoresis showed two clear bands,the relative molecular weight of the protein was 12.9 KDa and 11.8 KDa,that was,the composition of the bone gelatin group was divided into alpha 1 and alpha 2.

carp bone;gelatin;yield;study

TS254.9

A

2016-12-23

吉林农业科技学院青年基金项目（119012014022）

高倩倩（1982-），女，吉林省农安县人，实验师，从事食品化学研究。