3个不同派别杨树资源遗传多样性的SSR分析

韩志校，张 军，左力辉，任亚超

(1.河北农业大学 国有资产管理处，河北 保定 071000； 2.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001)

3个不同派别杨树资源遗传多样性的SSR分析

韩志校1，张 军2*，左力辉2，任亚超2

(1.河北农业大学 国有资产管理处，河北 保定 071000； 2.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001)

利用杨树28对SSR基本核心引物筛选出符合要求的13对引物，并采用这些引物对来自白杨派、黑杨派和青杨派的32个杨树无性系进行PCR扩增，同时对这些样品进行亲缘关系和遗传多样性分析。结果表明，13对引物共扩增条带58条，其中多态性条带58条，占扩增总带数的100.00%。对32个杨树样品的遗传距离进行分析，得到其遗传距离为0.056～0.741，表明各样品之间具有较丰富的遗传多样性。通过聚类分析可将供试样品分为三大类，即白杨派、黑杨派和青杨派，其聚类结果与传统分类学上的结果一致，说明SSR分子标记技术在杨树品种鉴定中具有一定的可靠性。

杨树； SSR； 遗传多样性

杨树属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)，为落叶乔木[1]。杨树在我国分布广泛，是我国重要的绿化树种和能源树种[2-5]。杨属植物种类繁杂多样，无性繁殖比较容易，杂交品种较多，分类较困难。随着生物技术的快速发展，分子标记技术是现阶段林木育种上品种鉴定、性状区分等常用到的技术手段[6]。SSR(simple sequence repeats)分子标记又称为微卫星分子标记，广泛分布在真核生物的基因组中,是一类由2～4个核苷酸组成的多次串联重复的DNA序列[7]。杨彦伶等[8]用杨树基因组SSR引物对6个苏柳品种进行了PCR扩增，结果表明，杨树SSR标记完全适合于柳树；梁海永等[9]用杨属的10个品种作为试验材料，采用SSR分析了各样品之间的亲缘关系；贾会霞等[10]用SSR标记构建了杨树品种的指纹图谱，证实用SSR标记可以有效监测亲本与子代之间的系谱关系。但SSR标记在不同派别杨树的遗传多样性研究方面尚未见报道，鉴于此，拟利用13对SSR高多态性引物对来自3个派别的32个杨树无性系进行遗传多样性分析，旨在为杨树无性系的鉴定和亲缘关系分析提供分子生物学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

2012年6月份从中国林业科学研究院苗圃(北京)、河北农业大学校园(保定)、河北威县林业局苗圃场(邢台威县)和东北地区(沈阳)收集杨树无性系32个，其中白杨无性系13个、黑杨无性系14个、青杨无性系5个。供试材料见表1。白杨和黑杨无性系均采取顶端嫩叶，将其用速封袋包装，放置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用；青杨无性系用硅胶进行干燥处理。全部试验在河北农业大学林木遗传育种实验室完成。

表1 供试材料概况

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取与引物选择 采用改进后的CTAB法[11]提取杨树基因组DNA。所提取的DNA使用Nanodrop2000检测质量浓度并稀释到20 ng/μL，用于SSR标记。

SSR引物序列来自国际杨树基因组委员会官方网站(http://web.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resources.htm)，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。从28对引物中选取13对多态性好、分辨率高、稳定性强、特异性高的引物用于PCR扩增，引物序列和名称见表2。

1.2.2 PCR反应体系与扩增程序 PCR反应体系为10 μL，各试剂含量为：2×TaqMaster Mix 5 μL，RNase-Free Water 3 μL，Template DNA 1 μL，Forward primer、Reverse primer各为0.5 μL。PCR扩增程序为：PCR扩增95 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，41～55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃ 20 min。

表2 引物序列与名称

1.2.3 凝胶电泳与显色 用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳40～50 min，然后凝胶用1%的AgNO3染色8～10 min，用去离子水漂洗2～3次，再用显色液浸泡2～3 min，直至条带显色清晰，并拍照记录。

1.3 数据统计分析

用二元性状(binary character)编码，选择扩增条带清晰且有多态性的SSR标记进行数据统计，假定胶上迁移率相同的条带均来自同一位点上的同一等位基因。对每个样品的扩增电泳谱带进行统计，有带记为1，无带或模糊的记为0，形成0/1数据矩阵输入计算机的 Excel 中。利用 POPGENE32和DPSv17.0软件计算遗传多样性参数与遗传距离。

2 结果与分析

2.1 杨树SSR引物多态性分析

利用选出的13对SSR引物对32份杨树无性系进行扩增，共扩增出条带58条，其中多态性条带58条，占100.00%，每对引物扩增的位点数为2～7个不等，平均每对引物扩增4.5个位点(表3)。

从扩增结果来看，SSR引物得到的扩增产物片

断大小主要分布在120～305 bp。每个引物的多态性都很高，都达到100.00%，这13对引物对所供试的32份杨树材料的区分率达到了100.00%。从图1可以看出，不同引物在相同材料中产生的谱带信息不同，同一引物在不同的材料中产生的谱带信息也不尽相同，这说明供试的杨树无性系在DNA水平上具有一定的差异。

表3 13对SSR引物所产生的谱带信息

M表示20 bp DNA Ladder Marker; 1—24为供试材料编号图1 引物ORPM206(A)和ORPM344(B)对部分样品的扩增谱带

2.2 杨属3个派别间的遗传多样性分析

由表4可知，杨属3个派别之间的多态位点百分率具有一定的差异，介于55.17%～75.86%，其中最高的为白杨派，最低的是青杨派，3个派别间的高低关系表现为白杨派>黑杨派>青杨派；而Nei′s基因多样性(h)、Shannon′s指数(I)和有效等位基因数(Ne)的高低关系表现为黑杨派>白杨派>青杨派。

表4 杨属3个派别间的遗传多样性指数

2.3 杨属3个派别间的遗传一致度与遗传距离

比较来自杨属3个派别间的遗传一致度与遗传距离(表5)发现，不同派别间杨树无性系的遗传距离介于0.096～0.190，遗传一致度介于0.827～0.909，尤其是黑杨派和青杨派之间的遗传一致度最高，表明这2个派别间的遗传分化较小，而白杨派和青杨派之间的遗传一致度最低。

表5 杨属3个派别间的遗传一致度与遗传距离

注：上三角为遗传一致度，下三角为遗传距离。

2.4 杨属3个派别的32份无性系的遗传多样性分析

利用UPGMA法对来自杨属3个派别共32份资源进行聚类分析可知，32份杨树无性系之间的遗传距离为0.056～0.741，平均遗传距离为0.359，其中，中林2000杨和欧美107杨之间的遗传距离最小，总之，试验所选取的杨属3个派别间的遗传距离变化较大，能较好地表现出各个杨树无性系之间的差异，表明选取的材料具有一定的代表性。

在遗传距离为0.580处，32份杨树无性系可以分为两大类，第Ⅰ类为全部白杨派的13个无性系，第Ⅱ类为全部黑杨派的14个无性系和青杨派的5个无性系，这与3个派别间的聚类结果相一致(图2)。

图2 32个杨树无性系的遗传聚类结果

3 结论与讨论

相对于其他分子标记，SSR分子标记以其周期短、试验可重复性强、多态性较高和不受环境影响而被广泛应用[12]。本试验采用SSR分子标记对32个杨树无性系进行了分析，其多态位点百分率为100.00%，均高于韩骞等[13]的93.40%和王辉等[14]的96.38%，说明本试验供试材料具有较大的差异。

本研究采用UPGMA法对杨树不同类群进行了遗传多样性分析。其中，黑杨派杨属植物与青杨派杨属植物聚为一类，白杨派单独聚为了一类，这一结果与于兆英等[15]认为白杨派与杨属其他内群之间有一定间隔的观点相一致。本试验中杨属3个派别间的Nei′s基因多样性(h)为0.184～0.217，其排列顺序依次是黑杨派>白杨派>青杨派，表明这3个杨属派别间遗传基础较为狭窄，这可能是因为，杨树常被人为地选择优良无性系进行杂交育种，使得所选育出的无性系常常出现一个共同的母本或父本，造成了遗传多样性较低的局面。对来自这3个派别的32份杨树无性系进行聚类分析，结果表明，这些杨树无性系之间的遗传距离为0.056～0.741，各无性系之间表现出了很大的遗传差异。所有杨树无性系可以分为两大类：一类是所有的白杨派无性系，另一类是所有的黑杨派和青杨派无性系，这一聚类结果与李树春等[16]对不同派别杨树无性系聚类分析结果一致，这也表明了黑杨派与青杨派之间亲和力较强，杂交易得到种子。

在每个派别的具体聚类中，具有相同起源的一些样品聚为了一类，如白杨派的毛白杨、易县雌株都为毛白杨的天然杂种，二者最先聚在一起；北林1号和北林2号是从白杨三倍体中选育出的无性系，具有相同的起源。在黑杨派中，中林46杨、中林2000杨、欧美107杨和欧美108杨聚为一类，这几个速生杨是美洲黑杨和欧洲黑杨的杂种后代，有着相同的起源；丹红杨和南杨是美洲黑杨36号杨与50号杨杂交后代的雌株和雄株，二者的亲本相同；中怀1号杨和中怀2号杨是美洲黑杨50号杨与帝国杨杂交后代的雌株和雄株，二者同样具有相同的亲本，在聚类中二者与身为亲本之一的美洲黑杨50号杨聚在一起；廊坊杨1与作为亲本之一的山海关杨聚在了一起，表现了较近的亲缘关系。在较细微的聚类中，杂交后代之间、杂交后代与亲本之间都有很强的关联性，往往有着相同亲本的无性系植株聚为一类，同时，有着同样起源的不同种的植株也聚在了一起，表明近源种植株之间也有着很强的关联性。因此，本研究结果进一步揭示了SSR分子标记技术在杨树品种鉴定中的可靠性，SSR分子标记技术在无性系聚类分析中具有一定优势。

[1] The Angiosperm Phylogeny Group.An ordinal classication for the families of flowering plants[J].Annals of the Missouri Botanical Garden,1998,85(4):531-553.

[2] 杨淑红,张瑞粉,孙淑云.AFLP分子标记技术在杨树遗传育种中的应用[J].河南林业科技,2009,29(2):55-58.

[3] 陈罡,邢兆凯,潘文利,等.辽宁地区主栽杨树品种的SRAP标记的遗传多样性[J].东北林业大学学报,2010,38(10):19-22.

[4] 冯锦霞,张川红,郑勇奇,等.利用荧光SSR标记鉴定杨树品种[J].林业科学,2011,47(6):167-174.

[5] 胡建军,杨敏生,卢孟柱.我国抗虫转基因杨树生态安全性研究进展[J].生物多样性,2010,18(4):336-345.

[6] 左力辉,韩志校,梁海永,等.不同产地中国李资源遗传多样性SSR分析[J].园艺学报,2015,42(1):111-118.

[7] 宪立杰,刘兴菊,李雪雁,等.葡萄种质遗传多样性的SSR分析及指纹库构建[J].北方园艺,2013(11):87-90.

[8] 杨彦伶,张亚东,张新叶.杨树SSR标记在柳树中的通用性分析[J].分子植物育种,2008,6(6):1134-1138.

[9] 梁海永,刘彩霞,刘兴菊,等.杨树品种的SSR分析及鉴定[J].河北农业大学学报,2005,28(4):27-31.

[10] 贾会霞,姬慧娟,胡建军,等.杨树新品种的SSR指纹图谱构建和倍性检测[J].林业科学,2015,51(2):69-79.

[11] 刘春英.杨树新品种(无性系)SSR和 ISSR指纹图谱的构建[D].杨凌:西北农林科技大学,2013.

[12] 郭小平,赵元明,刘毓侠.SSR技术及其在植物遗传育种中的应用[J].华北农学报,1998,13(3):73-76.

[13] 韩骞,王辉,王进茂,等.利用SSR引物通用性分析杨柳科树种遗传多样性[J].分子植物育种,2009,7(5):904-911.

[14] 王辉,杨敏生,朱建峰.利用SSR对杨属部分种及杂种的分析鉴定[J].东北林业大学学报,2008,36(12):4-6.

[15] 于兆英,张明理,徐炳声,等.杨属的分支分析[J].植物研究,1990,10(1):69-76.

[16] 李树春,夏辉,严冬,等.不同派别杨树无性系SSR遗传距离及聚类分析[J].植物研究,2015,35(1):68-76.

Analysis of Genetic Diversity ofPopulusfrom Three Different Factions by SSR Markers

HAN Zhixiao1,ZHANG Jun2*,ZUO Lihui2,REN Yachao2

(1.Stated-owned Assets Management Bureau,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China;2.College of Forestry,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China)

Thirteen pairs of SSR primers which met the requirements were screened from 28 pairs of poplar basic core primers.The PCR amplification of 32 poplar lines from Sect.LeuceDuby,Sect.AigeirosDuby and Sect.TacamahacaSpach was done by use of these primers,and the genetic diversity and genetic relationship of these samples were analyzed at the same time.The results showed that 58 DNA bands were obtained,and polymorphic bands accounted for 100.00% of amplification bands.The calculating results showed that the genetic distance of 32 poplar lines ranged between 0.056 and 0.741,which indicated that high genetic diversity existed among the samples.The result of cluster analysis showed that the samples could be divided into three clusters,namely Sect.LeuceDuby,Sect.AigeirosDuby and Sect.TacamahacaSpach.And the clustering results were consistent with the results of traditional taxonomy,which showed the reliability of SSR molecular marker technology in identification of different species ofPopulus.

Populus; SSR; genetic diversity

2016-12-08

国家林业局科技发展中心项目(XPC-201505)

韩志校(1987-)，女，河北石家庄人，助理实验师，硕士，主要从事实验室管理工作。 E-mail:hzx19870517@126.com

*通讯作者：张 军(1979-)，男，河北石家庄人，讲师，博士，主要从事林木遗传育种研究。E-mail:zhangjunem@126.com

S792.11

A

1004-3268(2017)04-0099-05