超声波辅助用乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶剂提取竹叶黄酮的工艺研究

朱万强，马周建

（遵义师范学院a.化学化工学院；b.黔北特色资源应用研究实验室，贵州遵义563006）

超声波辅助用乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶剂提取竹叶黄酮的工艺研究

朱万强，马周建

（遵义师范学院a.化学化工学院；b.黔北特色资源应用研究实验室，贵州遵义563006）

以芦丁为标准品，以赤水河流域的竹叶为研究对象，用超声波辅助乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶液对竹叶黄酮的提取进行了研究。以乙醇、乙酸乙酯和水的混合比例、超声时间、超声次数、固液比为主要因素进行L9(34)正交试验，结果表明黄酮的最佳提取工艺为：80%乙醇+15mL乙酸乙酯的混合溶液，超声时间25min，超声次数4次，料液比1:35，并对赤水河流域的7种竹叶进行了黄酮含量的测定。

赤水河流域；超声提取；竹叶；黄酮

贵州素有“竹子之乡”的美称，贵州遵义北部的赤水河流域，有着亚热带湿润季风的地理气候，盛产竹子，拥有丰富的竹类资源。可农民砍伐了竹子后，竹叶、竹枝任其自然腐烂，造成了自然资源的严重浪费。竹叶中的黄酮类物质具有结构稳定、难降解、可以直接进入人体病灶部位、亲水性很强等优点[1]，在调节血脂[2]、抗脂质过氧化、消除自由基[3]、抗应激和抗疲劳等方面有着显著的生物活性。与银杏黄酮相比，竹叶黄酮有更好的药理活性和低毒性[4]，资源更为丰富，且竹叶的收购成本更低。

竹叶黄酮是多种黄酮的混合物，它们的极性大小也各不相同。竹叶黄酮的提取研究基本分为：微波浸提法[5]、CO2超临界流体萃取法[6]、酶法提取[7]，甲醇、乙醇、热水浸提法[8]等。黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态不同有很大差异[9]。针对极性不同的黄酮，应选用极性不同的溶剂来提取。近年来，有许多超声波结合溶剂的提取方法，但在超声波结合溶剂提取法中，大多是超声波结合一种溶剂或两种溶剂来提取[10,11]。作者曾报道在超声波辅助下用乙醇-水混合溶剂提取竹叶黄酮的工艺研究[12]。混合乙酸乙酯溶剂的极性比水和乙醇小，有利于提取竹叶中极性较小的黄酮。本文对超声波结合乙醇、乙酸乙酯、水混合溶剂提取竹叶黄酮进行了研究，希望能对进一步开发竹叶资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹叶（赤水河流域），用自来水清洗干净，晾干后置于80℃的烘箱中烘30min，烘干后的竹叶经粉碎机粉碎，过90目筛，放置于棕色试剂瓶中密封待用。

芦丁，上海如吉生物科技公司；乙醇、乙酸乙酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，以上药品均为分析纯。

1.2 实验器材

202-O型台式干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂；晟喜牌CX-200型高速多功能粉碎机，上海缘沃工贸有限公司；TB-214型电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；SG-5200HD型双频超声波清洗器，上海冠特超声仪器有限公司；722S型可见分光广度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 提取方法

1.3.1 竹叶提取液的制备

精确称取制备好的竹叶粉末1.000g，加入一定比例的乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶液，在特定的条件下超声提取，过滤，用70%乙醇+15mL乙酸乙酯的混合溶液定容在50mL的容量瓶中。

1.3.2 黄酮的测定方法

取1.00mL提取液至50mL容量瓶中，加入70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液至12.5mL，摇匀，加入0.35mL质量浓度5%的NaNO2溶液，摇匀，静置5min，加入0.35mL质量浓度10%的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min，加入2.5mL1mol/L的NaOH溶液，摇匀，定容，静置10min后，在吸收波长处测其吸光度，再由芦丁为标准品的线性回归方程计算出溶液中黄酮类物质的含量[13]。

1.3.3 绘制芦丁标准曲线

用电子天平精确称取芦丁标准样品0.0096g，用70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液溶解并定容于50mL的容量瓶中，摇匀即得质量浓度为0.192g/L的标准溶液。

有关文献报道，芦丁在紫外光区和可见光区都有吸收，在紫外光区的吸收波长是370nm[14]，在可见光区的吸收波长为420nm[15]、510nm[16]，为此，本文对芦丁标准溶液的吸收波长进行了重新测定。

准确吸取1.0mL上述配制好的芦丁标准液至25mL容量瓶中，加入70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液至12.5mL，摇匀，加入0.35mL质量浓度5%的NaNO2溶液，摇匀，静置5min，加入0.35mL质量浓度10%的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min，加入2.5mL 1mol/L的 NaOH溶液，摇匀，定容，静置10min。以空白试剂为参比溶液，在340～450nm之间测定样品溶液的吸光度，结果表明芦丁标准溶液的最大吸收长为360nm。

准确移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL芦丁标准液于25mL容量瓶中，按上述方法配制溶液，在360nm处测定各样品的吸光度，最后以浓度C(mg/mL)为横坐标、吸光度A为纵坐标进行线性回归，结果见图1。

图1 芦丁标准曲线图

由图1可知，该曲线线性关系很好，标准曲线方程y=45.298x+0.0098，相关系数R2=0.9989，芦丁浓度线性范围0～0.0192g/L。

2 对黄酮提取工艺的研究

本文采用超声波辅助乙醇、乙酸乙酯和水的混合溶液来提取竹叶黄酮。为了减少实验的影响因素和实验次数，本文将超声仪器功率和频率固定为100%、59KHZ。因此，实验的主要影响因素为：固液比、超声时间、超声次数及乙醇、乙酸乙酯、水的比例。

2.1 单因素对竹叶中黄酮提取效率的影响

（1）提取剂的影响

准确称取4份苦竹叶粉末，每份1.0000g。固定固液比为1:25，在其他条件一致的前提下，分别用50%乙醇+15mL乙酸乙酯、60%乙醇+15mL乙酸乙酯、70%乙醇+15mL乙酸乙酯、80%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液超声提取竹叶黄酮，试验结果见表1。

表1 提取剂对竹叶黄酮提取效率的影响

由表1可知，采用70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液提取效果最好。

（2）固液比的影响

准确称取6份苦竹叶粉末,每份1.0000g。在其他条件一致的前提下，分别按固液比1:15、1:20、1: 25、1:30、1:35、1:40加入70%乙醇+15mL乙酸乙酯混合溶液，超声提取竹叶黄酮，试验结果见表2。

表2 固液比对竹叶黄酮提取效率的影响

由表2可知，当固液比为1:35时提取效果最好。

（3）超声次数的影响

准确称取苦竹叶粉末6份，每份1.0000g。在其他条件一致的前提下，分别采用不同的超声次数，每次25min，试验结果见表3。

表3 超声次数对竹叶黄酮提取效率的影响

由表3可知，超声次数增加黄酮含量增大，但超过5次黄酮含量反而降低，因此，最佳超声次数为5次。

（4）超声时间的影响

准确称取苦竹叶粉末6份，每份1.0000g。在其他条件一致的前提下，分别采用不同的超声时间，共超声3次，试验结果见表4。

表4 不同超声时间对竹叶黄酮提取效率的影响（黄酮含量：mg/g）

由表4可知，超声时间为20min时，黄酮含量最大，由此选取20min为最佳的超声时间。

2.2 最佳提取条件的确定

分别准确称取9份1.000g竹叶粉末，以同样的方法按四因素三水平的正交表L9(34)进行试验[17]，优化竹叶黄酮提取工艺，试验结果见表5、表6。

表5 正交试验因素及水平表

表6 正交试验结果

2.3 几种竹叶中黄酮的提取实验

精确称取赤水河流域的苦竹叶、楠竹叶、水竹叶、刺竹叶、慈竹叶、白夹竹叶、粽叶粉末各1.0000g，按正交试验所得的最佳试验条件提取竹叶黄酮，过滤，定容至 50mL容量瓶中。用移液管准确吸取1.0mL提取液至25mL容量瓶中，按上述黄酮测定方法配制溶液，用不加样品的溶液为空白参比，在360nm处测定吸光度，试验结果见表7。

表7 7种竹叶中黄酮的含量

3 结语

对超声波辅助乙醇、乙酸乙酯、水混合溶剂提取竹叶黄酮进行了研究，通过正交优化得到最佳工艺条件为：360nm为混合溶液最佳吸收波长；用料液比为1:35的80%乙醇+15mL乙酸乙酯溶液，超声条件下超声4次，每次25min，提取竹叶黄酮的效果良好。与之前作者用两种混合溶剂体系结合超声波辅助提取工艺比较[17]，由于第三种溶剂乙酸乙酯极性降低，对高极性黄酮溶解能力下降，因此固液比增大，超声时间延长，符合预期。赤水河流域7种竹叶中黄酮的含量分别为：水竹9.713mg/g、粽叶9.244mg/g、楠竹16.419mg/g、白夹竹16.778mg/g、刺竹17.523mg/ g、苦竹21.552mg/g、慈竹23.042mg/g。

两种方法提取的竹叶黄酮含量，有4种基本一致，其余3种有较大差异，其原因还待分析。可能的原因是加入极性较小的乙酸乙酯后，一部分原花青素等杂质溶出，带来了干扰，导致两种方法的结果不一致；还有一种可能是乙酸乙酯的加入，使原来某些低极性的竹叶黄酮被更多地提取出来。试验证明在乙醇混合溶剂中加入乙酸乙酯提取竹叶黄酮是可行的。

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（责任编辑：朱 彬）

A Study on Technology in Extracting Flavones from Bambooleaf under Auxiliary by Ultrasonic Wave in Mixed Solvent of Alcohol,Acetic Eether and Water

ZHU Wan-qiang,MA Zhou-jian
(a.Chemistry and Chemical Technology Institute;b.Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei,Zunyi Normal College,Zunyi Zunyi 563006,China)

With rutin as specimen and bamboo-leaf grown in Chi-shui river valley as subject,by means of ulitrasonic wave and in mixed solvent of alcohol,acetic ether and water,make a study of approach to extracting flavones from bamboo-leaf.L9(3)4 orthogonal experiment was used to investigate major factors,such as the mixed ratio of alcohol,acetic ether and water,ultrasonic time,frequency,and solid/ liquid ratio,etc.Rusults showed that the optional technology of extracting flavones is when 100 millitre per 80%alcohol solution mixed 15 millitre acetic ether,ultrasonic frequency is 4 times,every time lasts 25 minutes and the ratio of solid/liquid is 1:35.7 kinds flavones contents were determined coming from bamboo-leaf grown in Chi-shui river valley.

Chi-shui River valley;ultrasonic wave extracting;bamboos leaves flavones

TQ461

A

1009-3583（2017）-0110-04

2016-10-14

贵州省科学技术基金资助项目（黔科合J字LKZS[2012]27号）；遵义市特色水果贮藏与加工创新人才团队资助项目（遵市科合（2016）3号）

朱万强，男，贵州遵义人，遵义师范学院化学学工学院教授。研究方向：应用化学。