宁夏葡萄酒中白藜芦醇含量的高效液相色谱快速测定

冯愈钦，郭红艳，刘贵珊，何建国，王松磊，贺晓光

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

宁夏葡萄酒中白藜芦醇含量的高效液相色谱快速测定

冯愈钦，郭红艳，刘贵珊*，何建国，王松磊，贺晓光

（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

建立高效液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇的方法，考察直接进样法的检测波长、洗脱强度、流动相pH值、柱温、样品pH值等因素对酒样分离的影响，建立HPLC检测葡萄酒中白藜芦醇的方法，相关系数r为0.999 9，线性范围为1mg/L～20mg/L，精密度、稳定性、回收率试验的RSD分别为1.16%、2.9%和1.25%，酒样检测发现白藜芦醇的含量随酒的年份和品种变化，品种间比较结果为：蛇龙珠最优，梅鹿辄、赤霞珠、霞多丽次之，贵人香最低，其中蛇龙珠含量高达6mg/L。

白藜芦醇；高效液相色谱；回收率；葡萄酒

世界酿酒葡萄种植的地带是北纬30℃～50℃和南纬30℃～40℃之间[1-3]。我国的葡萄产区大部分在适宜葡萄生长的北半球10℃～20℃等温线之内，宁夏贺兰山东麓地区是酿酒葡萄适宜的生态区之一。种植面积已发展到5万多亩，占全国总面积31万亩的16%，在国内九大葡萄基地中名列第四位[4-7]。葡萄酒产业已成为具有明显地方特色的农业支柱产业之一。

白藜芦醇是葡萄酒中最主要的活性物质，具有抗癌、抗突变、延长寿命等作用，在葡萄酒中的含量在mg/L数量级，是衡量葡萄酒品质的一个重要依据。高效液相色谱法具有灵敏高、选择性强、快速分离等优点，适用于分析成分复杂、干扰项较多的痕量检测，是近年来研究的焦点[8-11]。

本研究将对西夏王葡萄酒品牌旗下的蛇龙珠、梅鹿辄、赤霞珠、贵人香、霞多丽5个品种采用直接进样法，寻找最适色谱条件，并对所建立的检测方法进行考察，用于不同品种、不同年份葡萄酒保藏过程中的白藜芦醇变化规律的深入研究。为我国原产地域命名葡萄酒质量标准体系研究奠定基础，这将对我国葡萄与葡萄酒产业发展具有重要理论意义和应用价值。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

AGILENT1100高效液相色谱仪、AQ-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）、一次性有机滤器（0.45μm×13mm）、滤膜（0.45μm×50 mm）：美国安捷伦科技公司；PHS-25 pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；ESJ-4A电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BT600-1J循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

白藜芦醇标品（纯度98%）：中国食品药品检定研究所；乙腈（色谱级）：美国CHROMADEX；2013、2014年份的西夏王干红（赤霞珠、梅鹿辄、蛇龙珠）、西夏王干白（霞多丽、贵人香）：宁夏西夏王葡萄酒业有限公司；甲醇（色谱级）、磷酸、氨水、去离子水、超纯水：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2样品的配制

白藜芦醇标准溶液的配制：称取白藜芦醇标品5mg，溶解于甲醇中，在100mL容量瓶中定容，摇匀，配制成50mg/L的标准溶液。用甲醇配制成1、2、4、6、10、20mg/L系列浓度梯度的标准溶液。高效液相色谱分析前，用0.45μm的一次性有机滤器过滤。葡萄酒经0.45μm一次性有机滤器过滤除去杂质。

1.3方法

采用AQ-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，二极管阵列检测器（即DAD检测器），进样量为10μL，流速为1.0mL/min，分别检测波长、洗脱强度、流动相pH值，柱温，样品pH值等因素对样品中白藜芦醇分离效果的影响，确定最终色谱条件。通过对标品溶液的进行全波长扫描，提取HPLC分析白藜芦醇的最佳检测波长。等度洗脱、梯度洗脱分离葡萄酒样品，比较不同条件下的分离效果，同时分析相应条件下的分离图谱，调节梯度洗脱中的洗脱强度，调解流动相pH值，寻找满足要求的梯度程序。用5%的氨水调节酒样pH值为4.0、5.0、6.0、7.0，按上述HPLC色谱条件测试，上样前过0.45μm一次性有机滤器过滤。柱温是HPLC分析中的重要分析参数，讨论色谱柱温度对分离酒样中白藜芦醇的影响，选取最适温度。通过标准曲线、精密度试验、稳定性研究、回收率研究考察仪器和方法的精密性、准确性、稳定性。

2结果与分析

2.1检测波长的选择

在190 nm～800 nm范围内对制备的白藜芦醇标准溶液进行全波长扫描，测定其紫外吸收图谱，如图1，考察白藜芦醇的最大吸收波长。

由图1可知，溶剂甲醇的吸收峰在200 nm附近，而白藜芦醇的最大吸收波长位于310 nm附近。已报到研究中，如沈齐英[12]、高年法[13]、孙德铁[14]等均设定白藜芦醇的HPLC分析的最佳检测波长为306 nm，与本次试验结果基本一致，故确定306 nm为高效液相色谱分析白藜芦醇的检测波长。

图1 白藜芦醇的紫外扫描图谱Fig.1 UV scanning spectra of resveratrol

2.2洗脱条件对样品分离的影响

流动相对样品分离的选择性取决于有机溶剂的种类，相应的分离强度则主要取决于流动相中有机溶剂所占的体积分数[15-17]。采用等度洗脱，A∶B=75∶25（体积比），柱温为30℃，检测波长306 nm时，4mg/L白藜芦醇标准品、2014年赤霞珠、2014年梅鹿辄酒样图谱。等压洗脱色谱图见图2。

图2 等压洗脱色谱图Fig.2 Isobaric elution chromatogram

由如图2可知，白藜芦醇标品的保留时间为15.13min，对称因子1.007，峰形较好，赤霞珠酒样保留时间为15.22min，分离效果较好，梅鹿辄在15.20min附近有重叠峰，没有得到理想的分离效果。

梯度程序1：磷酸调解水的pH=2.4，起始A∶B= 85∶15（体积比）；0～6min内，15%～20%B；6min～10min内，20%～28%B；10 min～20 min内，28%～35%B；20min～30min内，35%～50%B。该条件下，梅鹿辄酒样中白藜芦醇的分离效果较好，白藜芦醇的保留时间为16.41min，蛇龙珠酒样分离效果不够理想，酒样的色谱图如图3。进一步根据样品的色谱峰图分析，需增加流动相B的浓度，加大洗脱强度。

图3 梯度程序1洗脱色谱图Fig.3 Gradientelution chromatography 1

梯度程序2：磷酸调节A的pH=2.4，起始时A∶B= 65∶35（体积比），0～10min，保持35%B；10min～20min内，35%～100%B；20min～30min，保持100%B；30min～35min内，100%～35%B；35min～40min，保持35%B。酒样洗脱色谱图如图4。

由图4可知，改进的色谱条件下，白藜芦醇的保留时间为7.47min，标品中22min处为甲醇的吸收峰，蛇龙珠样品得到了良好的分离效果，且在白藜芦醇含量较少的干白中也取得了不错的分离效果。所以，最终被确定梯度程序2为最佳色谱条件。

2.3色谱条件的确定

2.1～2.2确定反相高效液相色谱法分析葡萄酒中白藜芦醇的色谱条件为，进样量为10μL，流速为1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长306 nm，梯度洗脱：A为去离子水（pH=2.4），B为纯乙腈，起始时A∶B=65∶35（体积比），0～10min，保持35%B；10min～20min内，35%～100%B；20 min～30 min，保持100%B；30min～35min内，100%～35%B；35min～40min，保持35%B。

2.4酒样pH值对样品分离的影响

葡萄酒中的酸类物质主要来源于两方面，即葡萄组织自身所含的酸和发酵过程产生的酸，一般葡萄酒的pH值在2.7～3.8范围内。按梯度程序2测试，发现白藜芦醇的峰面积变化甚微，说明进样量很少，样品的pH值对检测结果的影响很小。

2.5柱温的选择

图4 梯度程序2洗脱色谱图Fig.4 Gradientelution chromatography 2

柱温对HPLC分析物质的保留行为、峰形和分离选择性均存在影响。过低的柱温会降低待分离物质的扩散速度，致使分离效能降低，峰形变宽，保留时间变长；相反，过高的柱温会使样品中各个组分在固液两相中的扩散速度加快，同时挥发靠拢，不利于组分的分离[18-20]；如果柱温高于60℃，尤其在水相pH＜3或pH＞8的条件下，色谱柱的硅烷键合固定相很可能会发生水解。白藜芦醇在高温下不稳定，容易氧化，所以研究选择柱温为30℃。

2.6线性关系

按照浓度从小到大的顺序，依次准确吸取1、2、4、6、10、20mg/L系列浓度梯度的标准溶液，在2.3色谱条件下进样检测，得到相应峰面积。白藜芦醇的标准曲线见图5。

由图5得，白藜芦醇的线性回归方程为：y= 81.474x+5.321 9，相关系数r=0.999 9，线性范围为1mg/L～20mg/L，该研究范围内白藜芦醇的质量浓度和峰面积的线性关系良好，可以满足定量分析的要求。

图5 白藜芦醇的标准曲线Fig.5 Thestandard curveof resveratrol

2.7精密度研究

取2014年份赤霞珠干红葡萄酒，在2.3色谱条件下，连续重复进样5次，进行精密度研究，记录峰面积，计算相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），研究结果见表1。

表1 酒样的精密度研究结果Table1 Resu ltsof research on the precision ofwinesam ples

表明样品的峰面积基本稳定，计算得5次分析的RSD=1.16%，表明该方法下精密度良好。

2.8稳定性研究

取4mg/L白藜芦醇标准溶液，按确定的色谱条件分别在0、2、4、6、16、24 h进样检测。

表2 标样的稳定性研究结果Table2 Resultsof stability studies

由表2可知，随着时间的增加，标样检测的峰面积逐渐增大，白藜芦醇浓度的检测结果逐渐偏大，分析原因可能是研究室温度偏高，自动进样瓶中的甲醇随时间挥发。计算稳定性试验的峰面积的RSD为2.9%，表明检测条件下白藜芦醇的稳定性较好。

2.9加标回收率研究

回收率是指在既定的色谱条件下，在含有已知量白藜芦醇的样品中加入一定量的白藜芦醇标品，在相同检测条件下得到的分析结果添加量占实际添加量的百分比，计算公式[21-23]见（1）：

向已知浓度的2014年份赤霞珠样品中分别添加1、2、4mg/L的白藜芦醇标准溶液，在选定色谱条件下检测，计算。酒样的回收率研究结果见表3。

表3 酒样的回收率研究结果Table3 Resultsof recovery ofwine samp les

由表3可知，赤霞珠酒样的平均回收率为97.12%，RSD为1.25%。结果表明样品回收率良好，方法的准确性较高。

2.10实际样品的测定与含量比较

西夏王葡萄酒中白藜芦醇的含量随葡萄品种和年份的不同而变化，结果见表4。

表4 不同品种、年份葡萄酒中白藜芦醇含量Table4 Resveratrol content in grapew ine from different varieties and years

由表4表明：同一品种葡萄，年份不同，白藜芦醇含量也不同。红葡萄酒（蛇龙珠、梅鹿辄、赤霞珠）中白藜芦醇含量普遍较高，而白葡萄酒（贵人香、霞多丽）中白藜芦醇的含量则较低，其中蛇龙珠干红的白藜芦醇的含量最高，2014年份含量为6mg/L，2013年份含量为5.52mg/L；比较发现，白藜芦醇含量在葡萄酒中的含量变化为：蛇龙珠最优，梅鹿辄、赤霞珠、霞多丽次之，贵人香最低。

3结论

研究分别讨论并考察溶剂、检测波长、洗脱强度、梯度洗脱、流动相pH值，柱温，样品pH值等因素对样品中白藜芦醇分离效果的影响，建立了HPLC检测葡萄酒中白藜芦醇的方法、线性关系研究及精密度研究、稳定性研究、回收率研究。表明该方法的精密度、稳定性、加标回收率较好，适用于一般葡萄酒样品中白藜芦醇的的定量分析检测。样品检测发现红葡萄酒中白藜芦醇含量普遍较高，而白葡萄酒中白藜芦醇的含量则较低。该研究为白藜芦醇成分与特征研究提供理论依据，对葡萄酒中白藜芦醇的检测提供重要参考。

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Rapid Determ ination of Resveratrol in Ningxia W ine by High Performance Liquid Chromatography

FENGYu-qin，GUOHong-yan，LIUGui-shan*，HE Jian-guo，WANGSong-lei，HEXiao-guang
（AgriculturalCollege，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

The effectsof detection wavelength，solventstrength，mobile phase pH，column temperature，sample pH and other factorson the separation ofwineswere examined.A direct injection HPLCmethod for determination of resveratrol inwinewasestablished.The correlation coefficient rwas0.999 9，linear rangewas1mg/L-20mg/L，RSD ofprecision experiment，stability experimentand recovery experimentwere 1.16%，2.9%and 1.25%respectively.Itwas found that resveratrol contentofwines varied with years and varieties，its changing law was：CabernetGernischtwas the best chioce，Merlotand Cabernet Sauvignon and Chardonnay took second，the lastwasRiesling.Resveratrolcontent in CabernetGernischtwasup to6mg/L.

resveratrol；HPLC；rateof recovery；wine

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.033

2016-05-18

国家自然科学基金项目（31401480）

冯愈钦（1992—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：刘贵珊（1979—），男，副教授，博士，研究方向：功能性食品营养与评价。