复合食用菌多糖的免疫活性研究

李志涛，赵娟娟，王敏，郭继平，朱冰清

（衡水学院生命科学系，河北衡水053000）

复合食用菌多糖的免疫活性研究

李志涛，赵娟娟，王敏，郭继平，朱冰清

（衡水学院生命科学系，河北衡水053000）

研究了香菇、灵芝、平菇多糖按一定的比例混合得到的复合食用菌多糖对小鼠免疫活性的影响。小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果表明，复合食用菌多糖在低剂量下即对小鼠细胞免疫功能有显著提高作用；非特异性免疫试验结果表明，对小鼠的非特异性免疫功能只有在中剂量组和高剂量组才显示出增强作用；体液免疫试验结果表明，复合多糖在低剂量下即对小鼠体液免疫功能有显著提高作用。动物体外试验和体内试验结果表明，在适当的剂量范围内，与单一食用菌多糖相比，食用菌复合多糖具有较好的免疫调节功能。

食用菌；复合多糖；免疫活性

国内一些研究表明香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖均具有提高免疫能力的作用[1-3]。目前对食用菌多糖的免疫活性研究主要集中在研究单一食用菌多糖方面，而对复合多糖的免疫活性的研究很少。本文研究了香菇、灵芝、平菇多糖以一定比例复合后的复合食用菌多糖的免疫活性，为将来进一步将其开发成免疫调节剂提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

香菇、灵芝、平菇：市售。

1月龄清洁级小鼠[体重（20±2）g]：由天津医科大学提供。

RPMI1640完全培养液：Gibco公司；刀豆蛋白：Sigma公司；噻唑蓝：Sigma公司；台盼蓝：Amresco公司；胎牛血清：中国医学科学院生物工程研究所。

1.2试验仪器

FA1104A型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；Finnpipette移液器（100μL～1 000μL）：热电（上海）仪器有限公司；EMS-9B型加热磁力搅拌器：天津欧诺仪器仪表有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面洁净化工作台：苏州净化设备有限公司；752型分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3试验方法

将香菇、灵芝、平菇分别通过沸水浸提，95%乙醇沉淀后，经冷冻干燥得粗多糖。根据3种粗多糖中的活性多糖含量，将3种多糖分别按质量比1∶0.5∶1的比例混合得到复合食用菌多糖。测定该复合多糖的含量为7.1%。

1.3.1细胞免疫试验

参照毛学英[4]的方法进行试验。细胞培养以及OD值（光密度）的测定：将小鼠处死，取脾脏制备细胞悬液。在酶标板的每个孔加100μL细胞悬液，然后加入20μL完全培养液作为阴性对照；加10μL完全培养液，10μLCon A（刀豆蛋白A）作为阳性对照；取香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖、复合食用菌多糖分别配制成低、中、高剂量（分别为0.1、0.5、1mg/mL）组，阳性试验孔上同时加入10μLConA和10μL样品，在CO2培养箱（37℃、5%CO2）中进行孵育72h。在培养结束前7小时时每个孔加入10μLMTT（噻唑蓝，剂量为5mg/mL），培养结束以后每个孔加100μL 10%的SDS（十二烷基硫酸钠），然后测OD490nm值。免疫调节活性用刺激指数（Stimulate index，SI）来表示。SI值越大，代表样品免疫调节活性越强。

1.3.2非特异性免疫试验

用碳粒廓清试验[5]检测4种样品对小鼠的非特异性免疫的影响。

将78只小鼠随机分成13组，每组为6只。取香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖、复合食用菌多糖分别配制成低、中、高剂量（分别为0.1、0.5、1mg/mL）组，以生理盐水作为对照。每天灌胃1次，直至15天后结束。最后一次灌胃一天后，用印度墨汁对尾静脉进行注射，每只小鼠体重注射0.2mL墨汁，在注入后的第2、10分钟，分别从内眦静脉丛中取血20μL，然后加入到2mL 0.1% Na2CO3当中。用0.1%Na2CO3为空白对照，测OD600nm值。试验结束以后称量小鼠的体重、肝重、脾脏重。计算吞噬速率（K）、校正吞噬指数（a）：

式中：t1、t2分别表示第2、10分钟的采血时间；OD1和OD2分别表示t1和t2时对应样品的OD600nm。

1.3.3体液免疫试验

用定量溶血分光光度法[6]测小鼠脾脏抗体形成细胞生成含量。

试验小鼠分组的方法与灌胃剂量与1.3.2试验相同。每组为8只小鼠，每天灌胃1次，30天后灌胃结束。试验结束前5天，对小鼠腹腔注射2%的绵羊红细胞进行免疫。对小鼠进行免疫后，通过检测溶血过程中血红蛋白的量来反映其抗体产生的水平，在一定程度上能够代表机体的体液免疫水平[7]。试验结束后，取小鼠的脾脏研磨，PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤。离心10min（转速为2 000 r/min），取沉淀，之后加入1mL红细胞裂解液，静置10min后再次离心，加入2mLPBS悬浮。采用台盼蓝染色法使细胞的剂量为5×106CFU/mL。取该悬液0.5mL，分别取1mL 0.2%的SRBC（绵羊红细胞）和10%的豚鼠血清加入其中，对照组中不加悬液，用PBS补充。在37℃下温育，1 h后离心10min（转速为2 500 r/min），取其上清液，测OD430nm值。用OD430nm表示脾脏抗体形成细胞生成含量。

2结果与分析

2.1细胞免疫试验

4种样品在不同剂量下对小鼠脾淋巴细胞增殖活性影响如表1所示。

表1 4种样品在不同剂量下对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的影响Table1 Effectsof different dosagesof four kindsof sampleson sp lenic lymphocytemultiplication

从表1所示可以看出，低、中、高剂量的香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖、复合食用菌多糖与对照组相比刺激指数差异都显著（P＜0.05），这表明了4种样品在不同剂量下对小鼠脾淋巴细胞增殖活性均有一定的促进作用。当复合多糖剂量为0.5mg/mL时，与香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖相比刺激指数差异都显著（P＜0.05），与其他样品相比免疫调节活性最高，表明在适当的剂量范围内，与单一食用菌多糖相比，复合食用菌多糖具有较好的免疫调节功能；但是当剂量在超过0.5mg/mL时，免疫调节活性没有相应的提高，却呈下降的趋势，对小鼠脾淋巴细胞增殖呈现一定的浓度效应，表明复合多糖的剂量过高，并不能够相应地提高小鼠的细胞免疫调节活性，这说明剂量与提高小鼠的细胞免疫调节活性没有线性关系，导致这种情况发生的原因还有待于进一步研究。

2.2非特异性免疫试验

当细菌等外源性物质进入机体以后，可迅速被单核-巨噬细胞吞噬和清除，因此，巨噬细胞校正吞噬指数的多少可以反映吞噬功能的强弱[4]。4种样品在不同剂量下对小鼠吞噬细胞吞噬能力的影响如表2所示。

表2 4种样品在不同剂量下对小鼠吞噬细胞吞噬能力的影响Table2 Effectsof different dosagesof four kindsof sampleson phagocytosisability ofmacrophage

由表2可以看出，低剂量的香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖、复合食用菌多糖与对照组相比差异不显著，中剂量组和高剂量组与对照组相比差异显著（P＜0.05），表明4种低剂量样品不能显著提高小鼠清除碳颗粒的能力，不能对小鼠的免疫力产生良好的效应，而中、高剂量样品能显著提高小鼠清除碳颗粒的能力，可能是食用菌多糖可以激活处于抑制状态的巨噬细胞，又能够显著提高已经处于活化状态的巨噬细胞的功能，从而增强小鼠的非特异性免疫功能。中、高剂量复合食用菌多糖与香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖相比差异显著（P＜0.05），其校正吞噬指数最高，对小鼠吞噬细胞吞噬碳颗粒的能力显著提高。由试验结果可知，当复合食用菌多糖达到一定剂量后，随着剂量的增加能显著提高小鼠清除碳颗粒的能力。

2.3体液免疫试验

在小鼠的腹腔内注射绵羊红细胞后，其B淋巴细胞会产生抗绵羊红细胞抗体，通过补体的参与使细胞溶解，然后通过检测血红蛋白的含量反映抗体产生水平，以此代表机体的体液免疫水平[7]。4种样品在不同剂量下小鼠脾脏抗体形成细胞生成含量的影响如表3所示。

表3 4种样品在不同剂量下对小鼠脾脏抗体形成细胞生成含量的影响Table3 Effectsof different dosagesof four kindsof sam pleson productiveability of splenic antibody form ing cells inm ice

由表3可以看出，低、中、高剂量的香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖、复合食用菌多糖与对照组相比，小鼠抗体细胞生成含量差异显著（P＜0.05），这表明4种样品在不同剂量下对小鼠抗体细胞生成含量均有促进作用。高剂量复合食用菌多糖与香菇多糖、灵芝多糖、平菇多糖相比差异显著（P＜0.05）。由试验结果可以看出，当样品达到一定剂量后，随着灌胃剂量的增加，样品对小鼠抗体细胞生成含量的影响逐渐提高，尤其是复合食用菌多糖提高最明显，这表明复合食用菌多糖对机体体液免疫具有正调节作用。

3讨论

评价一种样品对机体免疫功能影响，至少要观察细胞免疫、非特异性免疫与体液免疫各一种，才能确认其对免疫功能的影响。本文就这3个方面考察了3种单一食用菌多糖和复合食用菌多糖对正常小鼠免疫功能的影响。本试验研究表明，复合食用菌多糖在低剂量下即对小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能有显著提高作用，但对小鼠的非特异性免疫功能只有在中剂量组和高剂量组才显示出增强作用，动物体外试验和体内试验结果表明，将香菇、灵芝、平菇多糖按一定比例复合后，在适当的剂量下，与单一食用菌多糖相比，复合食用菌多糖能显著提高小鼠的免疫功能，以上结果说明复合食用菌多糖具有较好的免疫调节功能。复合食用菌多糖比单一食用菌多糖对小鼠免疫功能提高明显，这可能是3种单一食用菌多糖复合后能相互补充，起到了协同增效的效果，这种情况发生的机理还有待于进一步研究。

[1]王頔,奚香君,王进进,等.宁心红杞和香菇多糖对小鼠免疫及内分泌功能影响的比较研究[J].中华中医药学刊,2013,31(10): 2171-2174

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[6]张儒珍,严俊,傅翠梅.定量溶血分光光度法体外检测B细胞功能[J].临床检验杂志,1987,5(4):182-183

[7]张绍章,田琼,李予蓉,等.蚯蚓提取物对小鼠脾脏抗体形成细胞的影响[J].第四军医大学学报,1993,14(5):350-352

Study on the Immune Effects of Edible Fungus Polysaccharides Compounds

LIZhi-tao，ZHAO Juan-juan，WANGMin，GUO Ji-ping，ZHUBing-qing
（Departmentof Life Science，HengshuiUniversity，Hengshui053000，Hebei，China）

Thisstudywasperformed to determinate immunoregulatory activity of themixture ofpolysaccharides of Lentinus edodes，Ganoderma luncidum and Pleurotus ostreatus.Splenic lymphocyte immunity：in the situation of low doses，polysaccharides compounds significantly promoted the splenic lymphocyte immunity inmice.Non-special immunity：polysaccharides compoundsonly atbothmedium and high doses significantly promoted the non-special immunity in mice.Humoral immunity：in the situation of low doses，polysaccharides compounds significantly promoted the humoral immunity inmice.All of the animal test showed thatedible fungus polysaccharides compounds significantly promoted the immunologic function inmice.atmoderate dose comparingwith single edible funguspolysaccharide.

edible fungus；polysaccharidescompounds；immunoregulatoryactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.009

2016-09-10

李志涛（1983—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品科学。