不同胁迫处理对银杏叶片萜内酯含量的影响

冯 如，李泽宏，袁红慧，程水源

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

不同胁迫处理对银杏叶片萜内酯含量的影响

冯 如，李泽宏，袁红慧，程水源

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

以2年生盆栽银杏苗为研究材料，通过人工紫外、干旱及不同浓度的矮壮素、赤霉酸对银杏叶片进行处理，探索外部胁迫对银杏叶片中萜内酯含量的影响。结果表明，经紫外、干旱及不同浓度的矮壮素、赤霉酸处理，银杏叶片中白果内酯，银杏内酯A、B、C和总萜内酯含量显著高于对照。随着紫外处理时间的增加，萜内酯含量先增加后减少并趋于平稳；在干旱和赤霉酸处理条件下，萜内酯含量呈“先增加后减少”趋势；在矮壮素处理条件下，萜内酯含量持续增加。多重胁迫共同对银杏叶片萜内酯含量的影响有待进一步研究。

银杏；萜内酯；胁迫

1 引言

银杏(Ginkgo biloba)为银杏科银杏属落叶乔木，是我国现存特有种子植物中最古老孑遗植物，具有很高药用价值，其主要有效成分为黄酮苷和银杏内酯类化合物[1- 2]。银杏萜内酯主要包括银杏内酯A，B，C和白果内酯(即GA，GB，GC，BB)，银杏叶萜内酯类成分是血小板活化因子(PAF)的特异性受体拮抗剂，预防血栓形成、支气管缩小和抑制过敏反应，有对中枢神经系统、缺血损伤的保护作用，被广泛应用于临床[3-4]。

药用植物的药效成分通常都是次生代谢产物，不少研究证实了逆境会促进这类次生代谢产物的增加。紫外辐射增强对植物黄酮、黄酮醇、花色苷，以及烯萜类化合物的增加有一定的影响[5]。干旱可以影响植物体次生代谢产物含量的变化，促进叶内黄酮苷和萜类内酯含量的增加[6-7]。矮壮素(chlorocholine chloride，CCC)是一种影响植物生长的调节剂，能够有效地使植物矮化，茎秆粗壮，提高植物体次生代谢产物的积累。赤霉素(gibberellin)能够促进植株生长、发芽、开花、结果，能刺激果实生长，提高结实率[8-9]。

由于银杏中萜内酯含量比较低，本实验拟用紫外、干旱及不同浓度的矮壮素(CCC)、赤霉酸(GA3)对其叶片进行处理，经过HPLC-ELSD进行萜内酯含量分析[10-14]，探索外部环境对银杏萜内酯含量的影响，为在银杏萜内酯的生产应用方面提供理论依据。

2 材料

2.1 仪器

高效液相色谱仪(Agllent 1260Infinity)；蒸发光散射检测器(Alltech)；恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；电子分析天平(METTLER TOLEDO)；超纯水(milli-Q)

2.2 材料与处理

2.2.1 材料

白果内酯、银杏内酯A、B、C标准品(均≥98%，上海源叶生物科技有限公司);银杏叶片(武汉轻工大学种植园)，柱层析硅胶(西亚试剂)，乙醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，四氢呋喃(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)，石油醚(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)。

2.2.2 处理

(1)将3株长势相同的银杏苗放入挂有紫外灯密闭箱内紫外处理，于12 h，24 h，36 h，48 h，72 h后进行采摘，每株采收5片生长良好的叶片，从叶柄基部剪去叶片立即以液氮速冻，并迅速带回实验室于-80 ℃冰箱中保存。

(2)将3株长势相同的银杏苗进行重度干旱胁迫处理(土壤相对含水量为50%左右)，于15 d，30 d，45 d后进行采摘，每株采收5片生长良好的叶片，从叶柄基部剪去叶片立即以液氮速冻，并迅速带回实验室于-80 ℃冰箱中保存。

(3)将CCC溶液处理设置为4个梯度浓度，即0(对照组)、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL(含有0.01%Tween20)，本实验处理方式如下：对银杏苗全株叶片喷施，包括叶片正反面，使全部叶片表面湿润，每个处理组设3株重复。每个处理组于1 d，2 d，3 d，7 d后进行采摘，每株采收5片生长良好的叶片，从叶柄基部剪去叶片立即以液氮速冻，并迅速带回实验室于-80 ℃冰箱中保存。

(4)将GA3溶液处理设置为4个梯度浓度，即0(对照组)、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL(含有0.01%Tween20)，本实验处理方式如下：对银杏苗全株叶片喷施，包括叶片正反面，使全部叶片表面湿润，每个处理组设3株重复。每个处理组于1 d，2 d，3 d，7 d后进行采摘，每株采收5片生长良好的叶片，从叶柄基部剪去叶片立即以液氮速冻，并迅速

3 方法

3.1 色谱条件

色谱柱：Agllent C-18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇：四氢呋喃：水=20：8：72；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；蒸发光散射检测器检测；漂移管温度90 ℃；载气为氮气；气体流速2.5 L/min；增阈值：4；进样量：20μL。

3.2 对照品溶液的制备

分别精密称取白果内酯，银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C为1.9 mg，1.0 mg，1.0 mg，0.9 mg，加1 mL甲醇溶解，作为对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

称取3份银杏叶片(每份约3 g)，剪碎后放入圆底烧瓶内，分别加入1/2的浸提溶液(60%乙醇水溶液，料液比为1∶150(g/mL))置于加热磁力搅拌器中， 60 ℃加热1 h后加入剩余部分浸提溶液并继续加热1 h，浸提完后趁热过滤，于旋转蒸发仪上蒸发浓缩后上硅胶柱，用洗脱剂石油醚：乙酸乙酯=1∶2(V/V)一次性洗脱，待烧瓶液体蒸干后加入2 mL甲醇充分溶解，经HPLC-ELSD检测内酯含量取平均值。对照品和供试品高效液相色谱图如图1、图2所示。

1-银杏内酯C; 2-白果内酯;3-银杏内酯A ;4-银杏内酯B图1 对照品高效液相色谱图

1-银杏内酯C;2-白果内酯;3-银杏内酯A ;4-银杏内酯B图2 供试品高效液相色谱图

3.4 线性关系考察

分别吸取对照品溶液并稀释为0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1 mg/mL，按照上述色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归方程，得银杏内酯C：y=11039x-915.77，R2=0.9991；白果内酯BB：y=16457x-3533.3，R2=0.9990；银杏内酯A：y=14548x-1532.7，R2=0.9990；银杏内酯B：y=10657x-1063.8，R2=0.9996。结果表明：四种内酯在0.18 mg/mL—1.9 mg/mL范围内线性关系良好。

3.5 精密度考察

精密吸取对照品溶液20μL，连续进样5次，测定相应峰面积。结果银杏内酯C RSD为1.2%，白果内酯BB RSD为1.8%，银杏内酯A RSD为1.4%，银杏内酯B RSD为1.7%，表明精密度良好。

3.6 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于0，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h注入高效液相检测，每个供试品溶液检测3次，取平均值并计算白果内酯，银杏内酯A、B、C的RSD值，分别为1.4%，0.91%，0.81%，0.87%，结果表明样品溶液在48 h内稳定。

3.7 重复性实验

取同一批银杏叶片样品5份，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，每个供试品溶液测定3次，取平均值并计算白果内酯，银杏内酯A、B、C的RSD值，分别为1.2%，0.44%，0.67%，0.53%，结果表明方法重复性良好。

3.8 回收率实验

精密称取5份已知含量的同一批银杏叶片，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，分别加稀释成0.2 mg/mL的对照品溶液适量，每个供试品溶液测定3次，取平均值并计算对照品的平均加样回收率，结果表明白果内酯，银杏内酯A、B、C加样回收率为92.54%，98.62%，95.55%，97.31%。白果内酯，银杏内酯A、B、C的RSD值，分别为1.4%，0.81%，0.92%，0.87%。

4 结果与分析

4.1 紫外处理对银杏叶片萜内酯含量的影响

紫外对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响如表1所示。从表1中可以看出白果内酯，银杏内酯A、B、C及总内酯随着紫外处理时间的增加，先增加后减少并趋于平稳，萜内酯在24 h和36 h之间积累量最大，总内酯相对于对照组提高了18.92%。

表1 紫外对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响

紫外/h银杏内酯C白果内酯银杏内酯A银杏内酯B总内酯0(对照)0．190．880．570．211．85120．211．010．510．282．01240．231．120．560．292．2360．221．090．520．272．1480．170．730．390．161．45720．170．720．380．181．45

4.2 干旱处理对银杏叶片萜内酯含量的影响

干旱对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响表如表2所示。从表2中可以看出白果内酯，银杏内酯A、B、C及总内酯随着干旱处理时间的增加，先增加后减少，其变化幅度并不明显，内酯含量明显高于对照组说明适当的干旱能促进银杏叶萜内酯的积累。

表2 干旱对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响

干旱/d银杏内酯C白果内酯银杏内酯A银杏内酯B总内酯0(对照)0．190．880．570．211．85150．190．920．590．221．92300．221．020．630．272．14450．210．970．60．262．04

4.3 CCC处理对银杏叶片萜内酯含量的影响

CCC对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响，如表3所示。从表3中可以看出白果内酯，银杏内酯A、B、C及总内酯明显高于对照组，且随时间、浓度的增加呈上升趋势。

表3 CCC对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响

CCC/(mg/mL)Time/d银杏内酯C白果内酯银杏内酯A银杏内酯B总内酯0(对照)0．190．880．570．211．850．05，10．221．040．610．262．130．05，20．221．040．610．272．140．05，30．221．030．620．272．140．05，70．231．050．620．292．190．1，10．221．050．640．292．20．1，20．221．050．640．292．20．1，30．231．050．660．32．240．1，70．231．060．660．312．260．2，10．251．060．650．332．290．2，20．251．070．660．332．310．2，30．261．070．680．342．350．2，70．271．080．680．362．39

4.4 GA3处理对银杏叶片萜内酯含量的影响

GA3对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响如表4所示。从表4中可以看出白果内酯，银杏内酯A、B、C及总内酯随GA3处理时间的增加，先增加后减少，萜内酯在3d处积累量最大，0.04 mg/mL GA3处理后银杏叶片中萜内酯含量明显高于其他两组。

表4 GA3对银杏叶片GC、BB、GA、GB和总内酯含量的影响

CCC/(mg/mL)Time/d银杏内酯C白果内酯银杏内酯A银杏内酯B总内酯0(对照)0．190．880．570．211．850．02，10．190．930．610．211．940．02，20．190．930．660．232．010．02，30．190．950．680．232．050．02，70．210．960．620．242．030．04，10．230．980．630．192．030．04，20．230．990．740．172．130．04，30．250．980．710．202．140．04，70．261．010．670．222．160．06，10．190．900．570．221．880．06，20．210．920．730．192．050．06，30．221．070．580．262．130．06，70．270．880．590．302．04

5 讨论

银杏叶片中所含的萜内酯主要是白果内酯，银杏内酯A、B、C均为银杏植物所特有的，但是由于叶中萜内酯含量极低，提取损失较大，因此银杏萜内酯的药用资源受到极大限制。本研究以紫外、干旱及不同浓度的矮壮素、赤霉酸对其叶片进行处理，探索外部环境对银杏萜内酯含量的影响。

本研究表明适当的紫外胁迫能够促进银杏叶片萜内酯含量的积累。而随着紫外胁迫时间的延长，白果内酯、银杏内酯A、B、C和总内酯含量反而急剧下降并趋于平稳，这与冷平生等的研究结果相似，光质对银杏萜内酯含量有显著影响，紫外处理下尤为突出[15]。长时间紫外处理导致萜内酯含量减少，表明长时间紫外处理抑制了银杏苗正常光合作用，使机体无法提供较多次生代谢产物前体，同时又增强了次生代谢产物的分解，使银杏叶片中萜内酯含量减少。

适度的干旱可以增加银杏叶片中萜内酯含量，但长时间干旱，萜内酯含量反而有所减少。在适度的干旱胁迫下，将同一代谢途经中相关基因结合在一起，有效隔绝了合成途径中产物在细胞内扩散，有利于酶促反应及底物与酶有效结合，减少细胞中毒伤害，从而刺激银杏萜内酯合成及保护银杏苗生长发育。长时间干旱会使得银杏光合作用受限，且植物首先尽可能进行初生代谢而不是此生代谢。本实验组在干旱处理组中未设轻度干旱及重度干旱，对此还需进一步实验完善。

CCC、GA3处理能显著提高银杏叶萜内酯含量，有助于萜内酯的积累。CCC、GA3处理能显著提高银杏光合作用，碳水化合物含量增加进而促进银杏次生代谢产物的合成，使银杏叶片中萜内酯含量增加。许峰等实验显示CCC能显著诱导银杏内酯合成途径中4个关键酶基因的表达，暗示了除了在生理水平外，CCC在分子水平上也可以调控银杏萜内酯合成[16]。笔者认为经外源GA3的喷施，抑制银杏体内GA3的合成，可能使合成萜内酯的前体物质朝银杏萜内酯的合成方向转化，从而促进萜内酯含量积累。

经紫外、干旱及不同浓度的矮壮素、赤霉酸对银杏叶片进行处理，银杏叶片中萜内酯均有不同程度积累。然而银杏叶片中萜内酯含量不是受单一因素的影响，经紫外、干旱及不同浓度激素多重因素共同对银杏叶片萜内酯含量的影响有待进一步研究。

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The effect of different stresses on terpene lactones contents of Ginkgo biloba

FENG-Ru，LIZe-hong，YUANHong-hui，CHENGShui-yuan

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023 China)

The effect of external stresses on terpene lactones contents of Ginkgo biloba grown in different conditions of artificial ultraviolet,droughts,chlormequat,gillerellic acid were investigated.The results showed the contents of bilobalide BB,ginkgolide GC,GA,GB and total terpene lactones in different growing conditions of artificial ultraviolet,droughts,chlormequat,gillerellic acid were significantly increased compared with the control group.Theterpene lactones contents were increased first and then declined，at last changed to level off under artificial ultraviolet stress; the terpene lactones contents were increased first and then declined under droughts or gillerellic acid stress;the terpene lactones contents continued to increase under chlormequat stress.The effect of multiple stress on the terpene lactones contents of Ginkgo biloba is expected for further research.

Ginkgo biloba;terpene lactones;stresses

2017-01-09.

冯如(1992-)，男，硕士研究生，E-mail：799809864@qq.com.

程水源(1965-)，男，博士，E-mail：s_y_cheng@sina.com.

国家自然科学基金(31400556/C1610)；湖北省自然科学基金创新群体项目(2011CDA117).

2095-7386(2017)01-0034-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.007

Q 945.78

A