蛋白A介质抗体吸附性能及耐碱性的量热学

盛　志，史清洪，白　姝

(1.天津大学化工学院，天津 300072； 2.中化集团沈阳化工研究院，沈阳 110021)

单克隆抗体(简称单抗)被广泛应用于生命科学研究、医学诊断和治疗等多个领域。单抗药物是治疗乳腺癌、哮喘、关节炎、银屑病、器官移植免疫排斥等多种疾病的特效药，是生物医药领域中成长最快的一类药物。抗体类药物销售额在2007年时就已经达到263亿美元，约占生物制药市场的35%[1]，预计在2017年将达到1 410亿美元。在过去的20～30年间单抗的生产工艺飞速发展，抗体的表达滴度和发酵规模都显著增加，20 000 L以上的反应器已被普遍采用。下游生产过程中的纯化技术逐渐成为单抗药物制备中的主要瓶颈，开发高效的抗体纯化技术成为单抗药物制备中亟待解决的重要问题。

蛋白A色谱对抗体具有很高的选择性和亲和性，抗体经过蛋白A色谱一步纯化就可以达到很高的纯度和收率，蛋白A色谱已成为抗体纯化工业中的金标准。0.5 mol·L-1NaOH清洗是绝大多数色谱介质在位清洗(clean in place, CIP)的标准方法，但传统的蛋白A色谱介质在碱性环境中的稳定性较差，难以耐受使用高浓度NaOH的CIP条件[2]。为了提高蛋白A色谱配基的碱性耐受性，已有研究者用蛋白质工程技术构建突变的蛋白A，并从中筛选出能够抵抗工业纯化中的恶劣的碱性环境的配基。天然蛋白A中含有5个抗体结合域,分别为A、B、C、D和E，每个结合域都可以独立地与抗体的Fc片段相结合，其中B结合域的研究最为广泛[3]。为了提高B结构域对碱性环境的耐受性，将位于28～29的残基Asn-Gly进行定向突变为Asn-Ala，得到重组的Z结构域[4]。此突变可以提高蛋白A在碱性环境下的稳定性，还降低蛋白A与抗体的Fab片段的非特异性吸附。研究表明将4或5个Z结合域头尾相连形成的重组突变蛋白A，与抗体的结合容量同天然蛋白A分子的结合容量相似。使用亲和色谱中的洗脱条件也更加缓和(洗脱pH值由3.3变为4.5)，是目前应用最为广泛的蛋白A配基之一。而将Z结合域的其他位置的天冬酰胺残基进行突变，还可以进一步增强Z结合域的稳定性[5]。

等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry, ITC)是用于定量研究生物分子相互作用的微量热测量方法，它可以直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。之前已经有报道ITC被应用于表征抗体分子和游离亲和配基(包括蛋白A、蛋白G和小分子合成亲和配基)的相互作用[6-10]，而且ITC也被用于考察疏水电荷诱导色谱介质对蛋白的吸附过程[11]。但抗体分子与蛋白A配基色谱介质结合的热力学分析还未见报道。

微量差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry，DSC)可以通过温度的升降检测生物分子发生的热量变化。生物分子在溶液状态中处于天然(折叠)构象和变性(去折叠)构象这2种状态的平衡。相变温度Tm(该温度时50%的生物分子为去折叠状态)越高，分子稳定性越强。DSC可用于蛋白类药物开发过程中的稳定性检测和药物的保质期预测[12]。

本研究使用ITC和DSC等量热学方法研究了重组蛋白A亲和色谱吸附抗体过程的热力学性质，得到了抗体与介质结合的焓变与熵变等热力学参数，为使用计算机模拟方法设计拟蛋白A亲和配基提供了可参考的数据，为进一步设计和改进重组蛋白A配基提供了基础。

1　材料和方法

1.1　材料

微生物培养用的胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID(英国)；γ-球蛋白(IgG)；1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDGE)；缩水甘油醚三甲基氯化铵(GTMAC)购自Sigma-Aldrich公司(美国)；Q Sepharose HP和Sepharose CL-6B介质购自GE Healthcare(美国)；BCA试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他试剂为本地采购的分析纯试剂。LB液体培养基配方：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1NaCl。LB固体培养基在上述配方中再添加15, g·L-1琼脂粉。

SpAZ是由化学法合成的，购自北京华大蛋白。SpA4z和SpA4m的基因委托北京华大蛋白合成，并连接到表达质粒pET-30a(+)-SpA4z和pET-30a(+)-SpA4m上，质粒导入大肠杆菌BL21菌株中进行表达。SpA4z和SpA4m的氨基酸序列见图1。

图1　SpAZ，SpA4z和SpA4m的氨基酸序列Fig.1　The amino acid sequence of SpAz，SpA4z and SpA4m

1.2　方法

1.2.1SpA4z和SpA4m的表达与纯化

将保存在-80 ℃冰箱中的含有质粒pET-30a(+)-SPA4Z的大肠杆菌BL21菌株在LB平板培养基上划线分离，挑取单菌落接种到含30 mg·L-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养，用作种子液。将种子液稀释200倍接种，于37 ℃，220 r·min-1下培养，待OD600值达到0.4～0.6后，加入终浓度为0.5 mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养6 h左右。菌体在4 800 r·min-1离心30 min后收集，用20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)重悬；重悬菌液经超声破碎后离心收集上清液。收集的上清液用0.44 μm滤膜过滤后备用。

使用Q-Sepharose High Performance离子交换色谱从上述的上清液中提取SpA4z。色谱平衡缓冲液为20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)，洗脱缓冲液为含1 mol·L-1NaCl的20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)，洗脱条件为洗脱缓冲液在30 min内由0%升至15%，目标蛋白SpA4Z在电导率为8～11 mS·cm-1下洗脱，见图2。收集的SpA4Z产物经透析除盐后，冷冻干燥备用。样品中蛋白纯度用SDS-PAGE分析。SpA4m的表达与纯化方法与SpA4z相同。

图2　纯化SpA的离子交换色谱图Fig.2　Ion exchange chromatograms for purifying SpA

1.2.2亲和介质的制备

SpA色谱介质通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)活化法将SpA配基偶联于Sepharose CL-6B上实现，见图3。具体方法如下：将质量分数为20%乙醇溶液保存的Sepharose CL-6B介质在G3漏斗用大量双蒸水洗涤，抽干10 min后，称取10 g抽干介质置于100 mL锥形瓶中，加入5 mL 75%(质量比)GTMAC、5 mL 0.645 mol·L-1NaOH。混合均匀后，将锥形瓶置于空气摇床中在170 r·min-1和25 ℃下反应过夜。反应后的介质用大量双蒸水清洗并抽干10 min；然后称取2 g抽干的介质置于25 mL三角瓶中，用1.2 mL 4.6 mol·L-1NaOH溶液充分悬浮后，加入4 mL BDDE；混合均匀，在35 ℃和170 r·min-1条件下，反应约2 h。反应后的介质经大量双蒸水洗涤后，加入10 mmol·L-1NaHCO3溶液平衡；平衡后的上述介质抽干10 min，抽干介质置于含有10 mmol·L-1NaHCO3的蛋白溶液中，充分悬浮后于37 ℃和170 r·min-1下反应约2 h。反应后介质用10 mL双蒸水清洗3遍并抽干。向抽干的介质中加入4 mL封闭缓冲液，封闭缓冲液由1 mL 巯基乙醇和9 mL 含0.5 mol·L-1NaCl的0.2 mol·L-1NaHCO3溶液配置。上述混合物于25 ℃和170 r·min-1反应过夜。得到的产物用10 mL下述溶液依次洗涤3遍：含0.15 mol·L-1NaCl 的0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH=8)和50 mmol·L-1乙酸(pH=4.5)。洗涤后的介质再分别用双蒸水和20%乙醇溶液清洗，最后保存于20%乙醇溶液中。配基密度采用BCA法进行测量。

1.2.3吸附平衡实验

本研究采用间歇法研究抗体在亲和介质上的吸附平衡。吸附实验中以含0.1 mol·L-1NaCl 的0.02 mol·L-1PBS缓冲液(pH 7.5)为吸附缓冲液，抗体溶液亦采用吸附缓冲液配置。具体实验方法如下：亲和介质用大量双蒸水清洗并抽干后，在吸附缓冲液中平衡4 h；平衡后将介质抽干10 min，依次称取0.01 g抽干介质分别置于1.5 mL离心管中，然后向每支离心管中加入1 mL不同浓度的抗体溶液。混合均匀后，离心管置于摇床中在25 ℃和170 r·min-1下震荡反应约8 h。反应结束后，离心管在4 000 r·min-1下离心10 min收集上清液并在280 nm下测定其中的蛋白浓度。然后，根据物料平衡公式(1)计算静态吸附量：

图3　亲和介质的制备Fig.3　The synthesis scheme of affinity beads

(1)

其中：q表示吸附剂上抗体吸附量(mol/g)，C0表示初始抗体浓度(mol·L-1)，C表示吸附平衡时上清液中抗体浓度(mol·L-1)，V表示液相体积(L)，m表示抽干的介质质量(g)。

1.2.4等温滴定微量热实验

等温滴定微量热实验使用VP-ITC(Microcal，美国)，所用的缓冲液与吸附平衡实验相同。用吸附缓冲液分别配置100 μmol·L-1的抗体溶液和10 μmol·L-1游离的SpA4Z的溶液，蛋白浓度用BCA法测定后，将上述溶液在24.8 ℃下各自恒温脱气20 min后，SpA4Z溶液注入样品池中，抗体溶液加入到滴定注射器中，以吸附缓冲液作为参比池溶液，在25 ℃下滴定样品池中的SpA4Z溶液，共滴定30滴，每滴7 μL，每滴间隔300 s，搅拌转速307 r/min。用相同方法测定抗体溶液与吸附缓冲液之间的稀释热。

亲和介质用大量双蒸水清洗，并用吸附缓冲液平衡4 h。抽干10 min，称取200 mg抽干介质，用2.5 mL吸附缓冲液充分悬浮。将介质悬浮液和抗体溶液在24.8 ℃下恒温脱气20 min后，介质悬浮液加入到样品池中，抗体溶液加入到滴定注射器中，以吸附缓冲液作为参比池溶液,在25 ℃下等温滴定样品池中的抗体悬浮液，每滴间隔20 min，搅拌转速307 r/min。

用相同方法测定SpAZ在偶联前后与抗体的结合过程热力学行为。

1.2.5示差扫描量热实验

示差扫描量热实验使用VP-DSC(Microcal，美国)，仪器的样品池体积为0.5282 mL。分别用含0.1 mol·L-1NaCl的0.02 mol·L-1PBS缓冲液(pH=6.0)和0.5 mol·L-1NaOH溶液配置SpAZ、SpA4z和SpA4m蛋白溶液(浓度均为1 g·L-1)。将含0.1 mol·L-1NaCl的0.02 mol·L-1PBS缓冲液(pH=6.0)及该缓冲液配置的蛋白溶液分别加入到参比池和样品池中，检测蛋白在pH值为6.0的稳定性。溶液在加入前先真空脱气30 min。在加热测试开始前设定实验温度平衡30 min。扫描温度范围为25～110 ℃，升温幅度为1 ℃·min-1。将0.5 mol·L-1NaOH及以0.5 mol·L-1NaOH溶液配置的蛋白溶液分别加入到参比池和样品池中，用相同的方法检测蛋白在碱性条件下的稳定性。数据处理均使用仪器自带的MicroCal-enabled Origin 7.0软件完成。

1.2.6色谱实验验证配基的碱性稳定性

将合成的SpA4z-sepharose和SpA4m-sepharose介质装于色谱柱Tricorn 5/50，柱体积约为1 mL。用0.5 mol·L-1的NaOH分别浸泡介质0 h、8 h和16 h。用NaOH浸泡后的介质进行色谱实验：对NaOH处理后的介质用平衡缓冲液平衡后进行上样；上样溶液为2 g·L-1IgG，流速为1 mL·min-1，上样量为40 mL，用平衡缓冲液冲洗40 mL，0.1 mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱10 mL，用0.5 mol·L-1的NaOH 再生10 mL。

2　实验结果与讨论

2.1　SpA4z和SpA4m的表达与纯化

SpA4Z蛋白(相对分子质量约27.4 kD)是由大肠杆菌发酵，将收集的细胞破碎，再将破碎后的上清液经离子交换色谱纯化获得。发酵液及各种步产物的SDS-PAGE电泳检测结果如图4所示。

图4　蛋白A表达和纯化产物电泳图Fig.4　SDS-PAGE profile of SpA4z expression

电泳结果显示，加入IPTG诱导后的全菌破碎液(电泳带1)在27.4 kD处有明显的蛋白条带，而发酵液离心上清液(电泳带2)中没有可见的目的蛋白，说明SpA4z主要为胞内表达；全菌液离心后，上清液中有明显的目的蛋白条带，而沉淀中的目的蛋白含量很少，说明SpA4z蛋白主要为可溶性表达。经离子交换色谱纯化得到的产物只有一条明显的电泳带，目的蛋白纯度大于95%，可作为亲和配基合成SpA亲和色谱介质。SpA4m的表达与纯化与SpA4z类似。

2.2　亲和介质的吸附抗体的热力学分析

实验测定了SpA4z-sepharoseh,SpAz-sepharose的吸附平衡等温线。用BCA法测得SpA4z-sepharose的配基密度为1.8 mg/g，SpAZ-sepharose的配基密度为0.83 mg/g (以gel计，下同)。根据SpA4z的相对分子质量为27.43 kD，SpAZ的相对分子质量为6.64 kD。从而得到SpA4z-sepharose摩尔配基密度为6.56×10-8mol/g，SpAz-sepharose摩尔配基密度为1.25×10-7mol/g。

图5　抗体在SpA4Z-Sepharose和SpAZ-Sepharose上的吸附等温线Fig.5　Adsorption equilibrium of SpA4Z-Sepharose and SpAZ-Sepharose

抗体在亲和介质上的吸附平衡实验结果为图5所示，亲和介质上蛋白质的吸附量q随溶液中抗体浓度C的增加而增加，直到达到吸附饱和。从图5中可以看出，吸附等温线符合Langmuir模型，可用方程(2)拟合抗体在亲和介质上的吸附平衡数据。

(2)

其中，qm和Kd分别为饱和吸附容量(mol/g)和解离常数(mol·L-1)。解离常数Kd为结合常数Kb的倒数，可以反映结合的亲和力大小，Kd越小表明亲和作用的结合力越强。

拟合后得到抗体在SPA4z-sepharose介质上的qm值为1.43×10-7mol/g，Kd为2.08×10-6mol·L-1；而抗体在SpAZ-sepharose介质上的qm为1.35×10-7mol/g，Kd为5.36×10-6mol·L-1。

SpA4z-sepharose摩尔配基密度为6.56×10-8mol/g，qm为1.43×10-7mol/g，即抗体与SpA4z亲和配基结合的化学计量比约为2.2∶1。SpAZ-sepharose摩尔配基密度为1.25×10-7mol/g，qm为1.35×10-7mol/g，抗体分子与SpA4z亲和配基结合的化学计量比约为1∶1。SpA4z含有4个抗体结合域，理论上能结合4个抗体分子，但实际上只能结合约2.2个抗体分子。而SpAZ却能与抗体分子以接近于1∶1的比例结合。Ghose等[13]的实验表明，含有5个抗体结合域的游离的SpA分子只能结合2.4～3.1个抗体分子，本实验用固定化的SpA4z分子，得到了类似的结果。当多个抗体与SpA4z结合时，分子之间可能存在空间位阻效应，使得SpA4z中4个抗体结合域不能被充分占用。

SpA4z-sepharose的Kd小于SpAZ-sepharose，说明抗体与SPA4z-sepharose介质的结合作用更强。本研究采用ITC测量了结合过程的焓变，以揭示结合作用的机制。抗体滴定SpA4Z-sepharose介质的滴定曲线如图6所示。

图6　抗体溶液与SpA4z-sepharose的滴定曲线Fig.6　ITC curves of SpA4z-sepharose

用仪器自带的MicroCal-enabled Origin 7.0软件对其积分并归一化得到抗体溶液与SpA4Z-sepharose的结合焓变ΔH为-47.8 kJ·mol-1，进而利用式(2)、式(3)、式(4)和式(5)，

(3)

ΔG=-RTlnKC

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

可计算得到，ΔG为-10.5 kJ·mol-1, ΔS为-125 J·(mol·K)-1。用相同的方法得到抗体与Z-sepharose的结合焓变ΔH为-10.1 kJ·mol-1，吉布思自由能变ΔG为-8.0 kJ·mol-1，熵变ΔS为-7.1 J·(mol·K)-1。

游离配基与抗体的等温滴定曲线如图7所示，游离配基与抗体结合的热力学常数可以直接由等温滴定量热法测得。SpA4z与抗体结合的ΔG为-42 kJ·mol-1，ΔH为-146 kJ·mol-1，ΔS为-350 J·(mol·K)-1。Z结合域与抗体结合的ΔG为-41 kJ·mol-1, ΔH为-138 kJ·mol-1，ΔS为-327 J·(mol·K)-1。

图7　抗体溶液与游离配基SpA4Z和游离配基SpAZ的滴定曲线Fig.7　ITC curves of free SpA4Z and SpAZ

SpAZ与SpA4Z固定化前后与抗体结合的热力学参数可参见表1。

表1　热力学参数

引发焓变的主要因素是静电相互作用，引发熵变的主要因素是疏水相互作用和构象自由度。由SpA与抗体结合的热力学参数可知，SpA与抗体的结合是由焓变驱动的，而熵变不利于SpA与抗体的结合，这与前人的研究一致[8]，SpA与抗体结合的主要是由静电相互作用驱动的。与SpAZ和抗体的结合相比，SpA4Z与抗体结合的焓变和熵变均有提高，而两者的自由能变非常接近，这暗示着配基中Z结构域单体数量增加所导致的焓变主要用于补偿熵变的降低。固定化之后SpA4Z-Sepharose与抗体的结合焓变较SpAZ-Sepharose迅速降低，虽然SpA4Z-Sepharose的结合过程熵变也有所降低，但自由能变的结果显示SpA4Z-Sepharose更有利于亲和吸附的进行。

2.3　蛋白稳定性检测

微量差示扫描量热结果，如图8所示。

图8　微量差示扫描量热结果Fig.8　Results of DSC

用MicroCal-enabled Origin软件拟合后得到的Tm值见表2。可以看出，PBS缓冲液环境下SpA4m的Tm值高于SpA4z，而Z domain的Tm值最低。这表明SpA4m的稳定性高于SpA4z，而单一Z结构域的稳定性最差。NaOH溶液使蛋白的Tm降低，稳定性下降。但同样NaOH条件下SpA4m的Tm值依旧高于SpA4z。实验表明，SpA4m的稳定性高于SpA4z，对SpA4z进行的突变提高了它的稳定性。

表2　DSC拟合结果

NaOH处理后的SpA4z-sepharose和SpA4m-sepharose亲和介质的色谱图9如所示。

图9　色谱实验检测SpA4z-sepharose和SpA4m-sepharose介质的耐碱性能Fig.9　Alkaline stability analysis of SpA4z-sepharose and SpA4m-sepharose

由图9可以看出，NaOH处理使得介质的吸附容量下降。对色谱峰进行积分分析，可知NaOH处理SpA4z-sepharose介质8 h后使其抗体结合容量下降到41%，处理16 h后使其结合容量下降到17%。NaOH处理SpA4m-sepharose介质8 h后使其抗体结合容量下降到77%，处理16 h后使其结合容量下降到47%。可以看出在NaOH处理后SpA4m-sepharose的吸附容量下降的比SpA4z-sepharose的少很多，说明SpA4m亲和介质在碱性条件下更稳定。

3　结语

将SpAZ、SpA4z和SpA4m分别偶联到琼脂糖介质。用等温滴定实验结合吸附平衡实验数据分别测定了SpAZ和SpA4z与抗体结合的热力学性质。实验表明固定化的SpAZ与抗体分子以约1∶1的比例结合；而固定化的SpA4z分子虽然含有4个抗体结合域，但只能结合约2.2个抗体分子。SpA4z-Sepharose与抗体结合的Kd值比SpAZ-sepharose与抗体结合的Kd值小，说明SpA4z-Sepharose与抗体的亲和性更强。利用等温滴定量热法测得结合焓，并计算出结合熵。实验表明，结合反应是由焓变驱动的，而熵变不利于反应的进行。SpA4z-Sepharose与抗体结合的焓变和熵变都比Z-Sepharose的要显著，但总体效果还是焓变比熵变的作用更大。

氢氧化钠是最常用的色谱CIP试剂，针对天然蛋白A对氢氧化钠碱性环境耐受性较差的问题。本研究使用微量差示扫描量热仪检测了SpA4z和SpA4m的稳定性，结合色谱实验表明同样经NaOH处理，SpA4m比SpA4z具有更强的稳定性。本研究工作有助于深化重组蛋白A配基与抗体的结合机制，为开发高效耐用的重组蛋白A色谱介质奠定了基础。

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