Mac-1在破骨细胞分化中的作用*

杨国曦， 朱庆生， 杨重飞

(第四军医大学附属西京医院骨一科， 陕西 西安 710032)

Mac-1在破骨细胞分化中的作用*

杨国曦， 朱庆生△， 杨重飞△

(第四军医大学附属西京医院骨一科， 陕西 西安 710032)

目的： 探究巨噬细胞分化抗原1(Mac-1)分子在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的破骨细胞分化中作用的分子机制。方法: 取4周龄C57BL/6J小鼠脾细胞，用RANKL及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导，同时用抗CD11b及抗CD18的特异性抗体进行处理，1周后对细胞核和细胞骨架进行染色；用抗CD11b抗体、干扰CD11b基因的慢病毒及其对照空载病毒处理RANKL诱导的破骨细胞，1周后对细胞进行免疫荧光染色；取4周龄C57BL/6J小鼠脾细胞用RANKL及M-CSF诱导，同时用抗CD11b抗体、干扰CD11b的慢病毒及其对照空载病毒分别进行处理，1周后提取总蛋白进行Western blot检测。结果: CD11b抗体组和双抗体组的多核细胞形成率低于对照组和CD18抗体组，双抗体组和CD11b抗体组之间多核细胞形成率的差异不具有统计学显著性；免疫荧光双标结果显示病毒组的CD11b、Syk及NFATc1表达强度均低于对照病毒组，CD11b抗体组的CD11b、Syk及NFATc1表达强度均低于对照组；Western blot结果显示，CD11b抗体组的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及 p-ERK/ERK水平均低于对照组，病毒组的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及p-ERK/ERK水平均低于对照病毒组。结论: Mac-1分子中CD11b亚基对破骨细胞分化具有促进作用。该分子通过激活下游Syk通路，上调c-Fos，增加ERK活性，最终上调NFATc1而促进破骨细胞的分化。

巨噬细胞分化抗原1； 破骨细胞； 慢病毒

破骨细胞由多个破骨前体细胞融合而成，是人体内唯一具有骨吸收功能的细胞。破骨前体细胞分布于外周循环和骨髓内[1-2]，因此，破骨前体细胞的迁徙对破骨细胞的融合和到达骨表面尤为重要。当破骨前体细胞分化至抗酒石酸磷酸酶阳性时，破骨前体细胞开始融合并最终形成成熟破骨细胞[3]。

作为黏附分子家族中的重要成员之一，整合素对破骨前体细胞的迁徙和分化具有非常重要的作用。整合素由α、β亚基以非共价结合的方式形成，其中，白细胞功能相关抗原1(leukocyte function-associated antigen-1，LFA-1/CD11a/CD18)和巨噬细胞分化抗原1(macrophage differentiation antigen-1，Mac-1/CD11b/CD18)主要表达在破骨前体细胞表面，并且在破骨细胞分化过程中扮演重要角色[4]。细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1/CD54)参与破骨细胞的迁徙和分化过程，且LFA-1和Mac-1均为ICAM-1的受体[5]， LFA-1与ICAM-1的相互作用在破骨细胞分化过程中是必需的[6]，而作为与LFA-1仅有一个亚基之差的Mac-1在破骨细胞分化中的作用研究尚少。

本研究将以原代破骨前体细胞为研究对象，通过抗体封闭和基因沉默等方式，研究Mac-1分子在核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)诱导的破骨细胞分化中的作用和初步分子机制。

材 料 和 方 法

1 动物

C57BL/6J小鼠选自第四军医大学实验动物中心；CD11b基因敲除小鼠(品系: B6.129S4-Itgamtm1Myd/J)购自JAX。于第四军医大学实验动物中心饲养繁殖。

2 主要试剂和仪器

CD11b单克隆抗体和CD18单克隆抗体(Abcam)；RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)购自Sigma；罗丹明标记的鬼笔环肽(Cytoskeleton)；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)购自CST；沉默Itgam(编码CD11b的基因)的慢病毒及其对照空载病毒(GeneCopoeia)。

荧光显微镜(Zeiss)；电子显微镜(Olympus)。

3 主要方法

3.1 肌动蛋白染色实验 取4周龄C57BL/6J雌性小鼠，取脾，研磨后利用70 μm细胞滤器过滤，取细胞滤液用α-MEM培养基及RANKL(100 μg/L)、M-CSF(10 μg/L)培育，同时于培养基中加入CD11b抗体和CD18抗体。对照组不加入抗体；CD11b抗体组加入5 μg/L CD11b抗体；CD18抗体组加入5 μg/L CD18抗体；双抗体组同时加入CD11b及CD18抗体。隔天换液并重新加入抗体，1周后，用罗丹明标记的鬼笔环肽染细胞肌动蛋白，DAPI染细胞核，在荧光显微镜下观察并拍照。

3.2 免疫荧光染色 在48孔板中利用RANKL和M-CSF诱导破骨细胞，以转染系数为10(每个细胞转染10个病毒颗粒)在病毒组加入沉默CD11b基因的慢病毒，对照病毒组加入对照空载病毒进行转染，CD11b抗体组加入CD11b抗体(5 μg/L)，对照组除加入RANKL(100 μg/L)和M-CSF(10 μg/L)外不做其他处理。培养1周后，吸出培养基，用Triton做透化处理，并分别孵育Ⅰ抗和Ⅱ抗，并用荧光显微镜拍照。

3.3 Western blot实验 提取各组破骨细胞细胞总蛋白。定量、电泳、转膜并封闭，分别孵育兔抗小鼠Ⅰ抗(1∶1 000)及羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)后，ECL 发光液化学发光，显影。采用Quantity One 软件进行扫描定量，计算各条带灰度值，并分别除以内参照β-actin灰度值。

4 统计学处理

采用SPSS 14.0 软件处理，计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 肌动蛋白染色结果

CD11b抗体组和双抗体组可见许多较小细胞团块，肌动蛋白呈绿色，细胞核呈蓝色，细胞分化不良，呈小圆球形，细胞核分散，未见多核融合现象；CD18抗体组和对照组可见较多大细胞，细胞分化良好，有较多圆盘状细胞团落，细胞核集中，多核融合现象突出。

CD11b抗体组和双抗体组多核细胞形成率低于对照组及CD18抗体组(P<0.05)；双抗体组的多核细胞形成率与CD11b抗体组比较差异无统计学显著性，见图1。

2 免疫荧光染色结果

CD11b(红色)染色结果显示：CD11b抗体组可见细胞表面附近零星分布红色荧光，提示CD11b分子被抗体封闭；对照组可见较多红色荧光分布于细胞表面附近；病毒感染组细胞表面附近基本未见红色荧光；对照病毒组可见细胞表面附近有较多红色荧光。

Figure 1.The fluorescence staining of osteoclast actin (×200) and the number of multinuclear cells. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control.

脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)染色结果显示：CD11b抗体组可见绿色阳性荧光主要分布于细胞胞浆内；对照组可见较多绿色荧光分布于包浆部位；病毒感染组可见胞内分布较少绿色荧光；对照病毒组可见绿色荧光均匀分布于细胞内。

活化T细胞核因子 1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)染色结果显示：CD11b抗体组可见细胞包浆部位少量绿色荧光；对照组可见较多绿色荧光分布于包浆内部；病毒感染组胞浆部位基本未见绿色荧光；对照病毒组可见包浆内较多绿色荧光，见图2。

3 Western blot实验结果

CD11b抗体组及慢病毒转染组CD11b、Syk、p-ERK/ERK、c-Fos及NFATc1灰度值均下调。各组条带曝光结果见图3，灰度值分析见表1。

讨 论

黏附分子是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质粘附的膜表面糖蛋白，参与细胞的黏附和分化过程，其表达的高低与包括炎症在内的病理过程密切相关。整合素是黏附分子家族的重要成员之一，是α、β2种亚基以非共价键结合构成的异二聚体[7]，参与细胞免疫应答及细胞黏附迁徙，在先天性免疫中至关重要，其缺失或封闭会严重阻碍免疫细胞向感染区域的迁徙渗透并导致病原体的大量繁殖[8]。整合素Mac-1由CD11b(αM)和CD18(β2)两个亚基组成，除上述功能外，该分子在信号转导[8]过程中同样发挥重要作用[9-11]。

Figure 2.Immunofluorescence staining of the osteoclasts with different treatments (×200). Red: CD11b; green: Syk and NFATc1.

CD11b分子可以在RANKL诱导的破骨细胞分化中发挥促进作用。本研究用Western blot 实验和免疫荧光染色结果表明，CD11b分子通过募集Syk分子，上调了其下游c-fos和ERK活性，最终上调起始破骨细胞分化的NFATc1转录因子，从而发挥促分化效应。Hayashi等[12]发现破骨细胞的形成率与细胞密度，而非细胞数量呈正相关，这是由于破骨前体细胞间融合需要Mac-1分子和ICAMs相互识别，这种识别使破骨前体细胞“意识”到其他前体细胞的存在，从而促进了细胞的迁移和融合，细胞密度越大，迁移距离越短，细胞融合率越高，在该研究中，经CD11b抗体处理后，RANKL诱导下的RAW264.7细胞系破骨细胞形成率较对照组显著下降；通过RNA干扰技术阻止RAW264.7细胞系表达CD11b后，RANKL诱导下的破骨细胞形成率较对照组降低，该研究结果在蛋白质和基因水平上说明了CD11b对破骨细胞的分化促进作用。

CD18分子在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中不发挥促进效应。在肌动蛋白染色结果中，经CD18抗体封闭，原代破骨细胞形成率与对照组无统计学差异，说明该分子在RANKL诱导的破骨细胞分化中不具备促进作用。CD11b的C-端凝集素结构域通过结合外源性受体，介导细胞的黏附及信号的胞外至胞内传导，证明了在Mac-1介导的细胞黏附和信号传导中，CD11b亚基起到主导作用，而不是CD18[13-14]。

表1 Western blot实验结果的半定量分析

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol virus group.

本实验以Mac-1分子为研究对象，证明了Mac-1的CD11b亚基可以通过激活Syk通路促进RANKL诱导的破骨细胞分化，而另一亚基CD18不具备相同功能，该结论为临床无菌性松动的治疗提供了一定的理论依据。

[1] Kindle L, Rothe L, Kriss M, et al. Human microvascular endothelial cell activation by IL-1 and TNF-alpha stimulates the adhesion and transendothelial migration of circulating human CD14+monocytes that develop with RANKL into functional osteoclasts[J]. J Bone Miner Res, 2006, 21(4):193-206.

[2] Brandi ML, Collin-Osdoby P. Vascular biology and the skeleton[J]. J Bone Miner Res, 2006, 21(5):183-192.

[3] Takeshita S, Kaji K, Kudo A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts[J]. J Bone Miner Res, 2000, 15(1):1477-1488.

[4] Okada Y, Morimoto I, Ura K, et al. Cell-to-cell adhesion via intercellular adhesion molecule-1 and leukocyte function-associated antigen-1 pathway is involved in 1α, 25(OH)2D3, PTH and IL-1α-induced osteoclast differentiation and bone resorption[J]. Endocr J, 2002, 49(3):483-495.

[5] Tani-Ishii N, Penninger JM, Matsumoto G, et al. The role of LFA-1 in osteoclast development induced by co-cultures of mouse bone marrow cells and MC3T3-G2/PA6 cells[J]. J Periodontal Res, 2002, 37(7):184-191.

[6] Garcia-Palacios V, Chung HY, Choi SJ, et al. Eosinophil chemotactic factor-L (ECF-L) enhances osteoclast formation by increasing in osteoclast precursors expression of LFA-1 and ICAM-1[J]. Bone, 2007, 40(9):316-322.

[7] Lim K, Hyun YM, Lambert-Emo K, et al. Visualization of integrin Mac-1invivo[J]. J Immunol Methods, 2015, 426(1):120-127.

[8] Zhou Y, Wu J, Kucik DF, et al. Multiple lupus-associa-ted ITGAM variants alter Mac-1 functions on neutrophils[J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(4):2907-2916.

[9] Li N, Mao D, Lu S, et al. Distinct binding affinities of Mac-1 and LFA-1 in neutrophil activation[J]. J Immunol, 2013, 190(8):4371-4381.

[10]Zhou H, Liao J, Aloor J, et al. CD11b/CD18 (Mac-1) is a novel surface receptor for extracellular double-stranded RNA to mediate cellular inflammatory responses[J]. J Immunol, 2013, 190(6):115-125.

[11]Silveira AA, Dominical VM, Lazarini M, et al. Simvastatin abrogates inflamed neutrophil adhesive properties, in association with the inhibition of Mac-1 integrin expression and modulation of Rho kinase activity[J]. Inflamm Res, 2013, 62(5):127-132.

[12]Hayashi H, Nakahama K, Sato T, et al. The role of Mac-1 (CD11b/CD18) in osteoclast differentiation induced by receptor activator of nuclear factor-κB ligand[J]. FEBS Lett, 2008, 582(10):3243-3248.

[13]Ross GD. Role of the lectin domain of Mac-1/CR3 (CD11b/CD18) in regulating intercellular adhesion[J]. Immunol Res, 2002, 25(2):219-227.

[14]滕晓英，王连唐. 破骨细胞功能调控与骨质疏松症[J]. 中国病理生理杂志， 2002, 18(8):1012-1015.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Role of Mac-1 in osteoclast differentiation

YANG Guo-xi, ZHU Qing-sheng, YANG Chong-fei

(TheFirstDepartmentofOrthopedics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:y384537310@126.com)

AIM: To investigate the function of macrophage differentiation antigen-1 (Mac-1) in receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation and the mechanisms. METHODS: The spleen cells were isolated from 4-week-old C57BL/6J mice, and cultured with RANKL, macrophage colony-stimulating factor and CD11b and CD18 antibodies for 1 week. The actin bundles were stained with rhodamine-labeled phalloidin, and nuclei were stained with DAPI. CD11b and CD18 antibodies, lentivirus with interfering vector plasmid of target geneItgam(encoding CD11b) and empty virus (control virus) were used to treat osteoclasts for 1 week, and then immunofluorescence staining was performed. CD11b antibody, lentivirus and control virus were used to treat osteoclasts for 1 week, and total protein was taken for Western blot. RESULTS: Lower multinuclear positive rates in the groups treated with CD11b antibody were observed than that in the groups treated with CD18 antibody and control group. Lower immunofluorescence intensity of Syk, CD11b and NFATc1 was found in CD11b antibody group than that in control group. Lower Syk, CD11b and NFATc1 immunofluorescence intensity was also observed in lentivirus group than that in control virus group.The results of Western blot analysis showed that the protein levels of CD11b, Syk, NFATc1, c-Fos and p-ERK/ERK in CD11b antibody group were decreased as compared control group. Compared with control virus group, the protein levels of CD11b, Syk, NFATc1, c-Fos and p-ERK/ERK in lentivirus group were also decreased. CONCLUSION: CD11b subunit of Mac-1 promotes osteoclast differentiation by up-regulating c-Fos, ERK activity and NFATc1.

Macrophage differentiation antigen-1; Osteoclasts; Lentivirus

1000- 4718(2017)03- 0539- 05

2016- 09- 27

2016- 12- 09

国家自然科学基金资助项目(No. 81301541)

△通讯作者 Tel: 029-86126666； E-mail: y384537310@126.com

R31

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.026