Guttiferone K诱导人前列腺癌LNCaP细胞G0/1期阻滞的作用研究*
2017-04-10翟葳冯极灵席志超谭红胜
翟葳,冯极灵,席志超,谭红胜**
(1.上海中医药大学中药学院上海201203;2.中药创新药物研发上海高校工程研究中心上海201203)
Guttiferone K诱导人前列腺癌LNCaP细胞G0/1期阻滞的作用研究*
翟葳1,2,冯极灵1,2,席志超1,2,谭红胜1,2**
(1.上海中医药大学中药学院上海201203;2.中药创新药物研发上海高校工程研究中心上海201203)
目的:本文主要观察从云南藤黄Garcinia yunnanensis中提取分离得到的多环多异戊烯基间苯三酚(Polycyclic Polyprenylated Acylphoroglucinols,PPAPs)类化合物Guttiferone K(GUTK)对人前列腺癌LNCaP细胞增殖情况的影响。方法:取处于对数生长期的人前列腺癌LNCaP细胞,给予GUTK。采用MTT法检测细胞增殖的情况;采用PI染色的流式分析法、BrdU法及免疫细胞化学法检测细胞的周期分布;采用Western Blotting法检测Cyclin A、p27和激酶相关蛋白-2(S-Phase Kinase-Associated Protein 2,SKP2)蛋白水平的变化。结果:GUTK呈时间和剂量依赖性地抑制人前列腺癌LNCaP细胞的增殖;GUTK能够诱导人前列腺癌LNCaP细胞的G0/1期细胞周期阻滞;GUTK能够下调人前列腺癌LNCaP细胞Cyclin A和SKP2蛋白的表达水平并上调p27蛋白的表达水平。结论:从云南藤黄中提取分离得到的化合物GUTK能够通过诱导人前列腺癌LNCaP细胞G0/1期细胞阻滞来抑制细胞的增殖,具有潜在的抗肿瘤作用。
Guttiferone K细胞周期前列腺癌抗肿瘤作用
前列腺癌作为当今全球男性癌症中发病率最高的癌症[1,2],因其发病率、死亡率高严重影响男性健康,亟需开发有效药物来治疗和控制病情。本课题组前期研究发现,GUTK具有潜在的抑制前列腺癌复发的作用[3,4],但对其是否有治疗作用尚不清楚。本文拟在已有研究基础上,进一步探究GUTK对于前列腺癌的药效及作用机制。人前列腺癌细胞株——LNCaP,是由Horoszewicz等[5]从前列腺癌患者的淋巴转移灶中分离得到的,它保留了早期前列腺癌对雄激素依赖的特征。本研究选用人前列腺癌LNCaP细胞,旨在重点关注GUTK对前列腺癌细胞增殖的影响,并对其作用机制做初步探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人前列腺癌LNCaP细胞购自美国ATCC细胞库。培养基为RPMI1640(美国GIBCO公司)。
1.1.2 药品与试剂
Guttiferone K(GUTK)为本课题组于云南藤黄中提取分离得到的化合物,纯度为98%;MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)购自江苏碧云天生物公司,二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司(批号:D4540);琼脂糖和石蜡液购自美国Thermo公司(批号:111860、1210056);BrdU购自德国BoehringerMannheim Biochemica公司;碘化丙啶(PI),苏木素染料,甘油明胶封片液,RNase A,免疫染色封闭液和DAB显色液购自江苏碧云天生物公司;Cyclin A(ab185619)、SKP2(ab183039)、α-Tubulin(ab7291)和p27(ab32034)抗体均购自美国Abcam公司(批号:2011、GR97918-4、1912、0912)。
1.2 仪器
实验仪器有:细胞培养箱(美国Themo公司,型号:3541),光学倒置显微镜(日本OLYMPUS公司,型号:CX21),离心机(美国Eppendorf公司,型号:5811),全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司,型号:Synergy HTX),流式细胞仪(美国BD公司,型号:FACSCalibur)。
1.3 方法
1.3.1 应用MTT法检测GUTK对人前列腺癌LNCaP细胞增殖的影响
取对数期人前列腺癌LNCaP细胞,经0.25%胰蛋白酶消化,以4×103/孔的细胞密度接种于96孔板内,常规培养24 h,实验组加入2.5-30.0μM浓度的GUTK,对照组加入最高浓度所对应的DMSO(浓度<0.5%),每组设6个平行复孔。常规培养24、48、72 h后,每孔加入MTT溶液(5mg·mL-1,溶于1%的PBS溶液)10μL,常规培养4 h,弃上清,每孔加入二甲亚砜150μL,振荡。酶标仪以波长570 nm检测每孔吸光度,以加入GUTK的浓度为横坐标、以存活率(存活率=吸光度GUTK值/吸光度DMSO值×100)为纵坐标,绘制24、48、72 h人前列腺癌LNCaP细胞的生长曲线,计算IC50和IC75。
1.3.2 应用PI染色的流式分析法检测GUTK对细胞周期分布的影响
取对数期人前列腺癌LNCaP细胞,经0.25%胰蛋白酶消化,接种于培养皿中。24 h后分别加入6μM GUTK、12μM GUTK和DMSO处理72 h;收集细胞,PBS重悬细胞,以体积PBS∶体积无水乙醇为3∶7的比例逐滴加入预冷的无水乙醇,固定细胞;用500μL含浓度为20μg·mL-1的PI和100μg·mL-1的RNase A的PBS重悬细胞,避光孵育,PBS重悬,流式细胞仪检测,FlowJo软件(8.1.1版本)分析GUTK对细胞周期分布的影响。
1.3.3 应用BrdU法及免疫细胞化学法检测GUTK对诱导人前列腺癌LNCaP细胞G0/1期细胞阻滞的影响
取对数期人前列腺癌LNCaP细胞,经0.25%胰蛋白酶消化接种于6孔板内,并同时分别给予6μM GUTK、12μM GUTK和DMSO处理细胞,每组平行两个复孔,72 h后加入0.03μg·mL-1BrdU孵育8 h,收集细胞。以1mL 10%中性福尔马林制细胞悬液,固定细胞;将1%琼脂糖包裹的细胞沉淀,进行石蜡包埋,切片,脱蜡。孵育一抗室温下1 h或者4℃过夜,TBS清洗,孵育二抗30min,TBS清洗,浸泡。按ABC法检测,苏木素衬染,脱水,封片。显微镜40×物镜下观察GUTK对诱导人前列腺癌LNCaP细胞的G0/1期细胞阻滞的影响。
1.3.4 Western Blotting检测SKP2、Cyclin A和p27蛋白的表达
取对数期人前列腺癌LNCaP细胞,经0.25%胰蛋白酶消化,接种于培养皿内培养24 h后,分别加入6μM GUTK、12μMGUTK和DMSO处理72 h,收集细胞。使用RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和PMSF按照100∶1∶1∶1混合均匀的混合液裂解细胞;BCA法测定蛋白浓度;30μg蛋白样品与蛋白上样缓冲液混合;样品上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗及二抗;于膜上滴加ECL曝光液,置于成像仪内曝光、摄片。
1.3.5 统计学分析
采用Excel2013软件及SPSS 11.5统计软件分析;数据以xˉ±s表示。用Students’t-test方法进行两组间的比较,P<0.05或P<0.01为差异有显著或极显著统计学意义。
2 结果与分析
2.1 GUTK抑制人前列腺癌LNCaP细胞的增殖
采用MTT法检测不同浓度的GUTK在体外分别作用LNCaP细胞24-72 h后对细胞存活率的影响,绘制人前列腺癌LNCaP细胞的生长曲线。结果如图1所示,GUTK呈时间和剂量依赖性地抑制人前列腺癌LNCaP细胞的增殖。计算72 h的IC50、IC75分别为6μM和12μM,并以此浓度开展后续实验。
2.2 GUTK诱导人前列腺癌LNCaP细胞发生G0/1期细胞阻滞
为验证GUTK通过调节细胞周期进程从而发挥抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖的作用,采用PI染色的流式细胞术观察GUTK处理对人前列腺癌LNCaP细胞周期分布的影响,结果如图2所示。分别用6μM GUTK、12μM GUTK和DMSO处理LNCaP细胞72 h,发现经GUTK处理的实验组处在S期和G2/M期的细胞数较DMSO组明显降低(图2A)。分别对处在不同时期的细胞比例进行统计,DMSO组与6、12μM GUTK组处在G0/1期的细胞比例分别为62%、77%和81%,与DMSO组对比具有显著性差异,S期比例分别为20%、10%和12%,G2/M期比例分别为17%、11%和7%(图2B)。以上结果表明,GUTK可以呈剂量依赖性地增加处于G0/1期的细胞,阻止细胞周期由G0/1期进入S期的进程,即GUTK有明显诱导LNCaP细胞G0/1期阻滞的作用。
图1 GUTK抑制人前列腺癌LNCaP细胞增殖的情况(MTT法)
图2 GUTK对LNCaP细胞的细胞周期分布的影响(PI流式分析法)
2.3 BrdU法验证GUTK抑制人前列腺癌LNCaP细胞由G0/1期进入S期
BrdU可以在DNA合成时竞争性替代碱基“T”,从而插入染色体,并通过免疫细胞化学的方法进行检测分析。为了验证GUTK具有诱导人前列腺癌LNCaP细胞G0/1期阻滞的作用,本文选择BrdU法检测经GUTK作用后,人前列腺癌LNCaP细胞处于S期的比例。结果如图3所示,与加入DMSO的对照组相比,加入6μM GUTK和12μM GUTK的LNCaP细胞处在S期的比例明显减少,且加入GUTK的剂量越高,S期的细胞比例越低。说明GUTK可以剂量依赖性地阻碍人前列腺LNCaP细胞进入S期。
2.4 GUTK可下调人前列腺癌LNCaP细胞中Cyclin A和SKP2蛋白的表达水平,并上调p27蛋白的表达水平
Cyclin A为S期的特征性细胞周期蛋白,存在于细胞核中,其合成在细胞周期由G1进入S期时有明显的增加,主要作用与DNA的复制有关[6]。S期细胞SKP2属于泛素蛋白酶体系统的组成部分,通过特异性招募底物蛋白进行泛素化降解而参与细胞周期的调控。SKP2能通过调控抑癌基因p27的表达从而阻滞细胞周期于G1期[7]。p27是一种抑癌基因,对细胞周期起负调控作用,主要通过阻止细胞由G1期进入S期实现抑制肿瘤增殖的作用[8]。结果如图4所示,与DMSO组相比,加入6μM和12μM GUTK处理72 h的样品中,SKP2、Cyclin A蛋白的表达量显著下降,而p27蛋白的表达量明显升高。以上结果表明,GUTK通过下调SKP2和Cyclin A蛋白的表达量和上调p27蛋白的表达量来实现诱导LNCaP细胞的G0/1期阻滞的作用。
图3 GUTK对人前列腺癌LNCaP细胞进入S期的影响(BrdU法)
3 讨论
GUTK是从中国藤黄属植物云南藤黄中提取分离得到的小分子化合物。本课题组前期已发表了GUTK抑制前列腺癌复发的研究[3,4]。GUTK能够在静止期前列腺癌细胞激活过程中抑制DNA的合成,并诱导细胞周期阻滞,延缓癌症复发的进程。同时,GUTK能够通过增加FBXW7蛋白的稳定性来促进c-MYC在泛素-蛋白酶体途径的降解,从而下调c-MYC蛋白的表达,降低GUTK抑制静止期前列腺癌细胞重新激活的能力。此外体内实验表明,GUTK还能够抑制静止期前列腺癌细胞PC-3裸鼠皮下移植瘤的生长。综上,GUTK具有潜在的抑制前列腺癌复发的作用。
本文进一步考察了GUTK对前列腺癌的治疗作用。本研究首先采用MTT法确定了GUTK抑制人前列腺癌细胞增殖的作用,再以PI染色的流式分析法、BrdU法及免疫细胞化学法相互佐证确定GUTK对于细胞周期阻滞的作用,后用Western Blotting法检测周期相关蛋白表达水平的变化,初步探究了GUTK的作用机理。以上实验结果从细胞水平和蛋白水平验证了GUTK能够诱导前列腺癌LNCaP细胞发生G0/1期阻滞,进而抑制前列腺癌细胞增殖的作用。
目前本研究主要考察了GUTK抑制人前列腺癌的体外活性,而对GUTK在体内是否可以有效的抑制前列腺癌还需要进行后续的研究。课题组在前期研究中已经对GUTK的体内抗肿瘤活性和毒性进行过一定的评价,可为本文的后续研究提供参考。根据已报道的研究结果,在人静止期前列腺癌PC-3细胞形成的前列腺癌复发模型中[3],预防性给予10mg·kg-1的GUTK可明显抑制前列腺癌的复发,而不造成明显毒性。该研究中GUTK体外所用浓度为13μM,与本文所用体外浓度相近。根据以上GUTK体内的实验结果推测,10mg·kg-1剂量的GUTK可能在安全无毒的情况下发挥其抗肿瘤作用。
目前针对前列腺癌的不同阶段,临床已有多种治疗方案,但是每种治疗方案均存在弊端,需要开发高效低毒的新型药物。天然产物是先导化合物研发的重要来源之一,具有结构新颖、低毒、高活性的特点。GUTK源自可食用的中国藤黄属植物云南藤黄的果实,本研究发现GUTK可通过下调SKP2和Cyclin A蛋白的表达水平以及上调p27蛋白的表达水平诱导人前列腺癌LNCaP细胞发生G0/1期细胞周期阻滞,进而抑制人前列腺癌LNCaP细胞的增殖。结合前期研究和本文的结论,GUTK可能发挥预防和治疗前列腺癌的双重作用,有望开发成为前列腺癌的新型治疗药物。本研究的发现还将为GUTK作为安全低毒的细胞周期抑制剂与化疗药物联用治疗前列腺癌提供新的思路。后续研究将在本文结论的基础上,对GUTK抑制前列腺癌细胞增殖的体内药效研究及作用机制做深入的研究,同时考虑将GUTK与化疗药物联用,以寻求缓解耐药性、增加化疗药效的高效前列腺癌治疗方案。
图4 GUTK作用后人前列腺癌LNCaP细胞中Cyclin A、SKP2和p27蛋白的表达水平
1韩苏军,张思维,陈万青,等.中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析.临床肿瘤学杂志,2013,18(4):330-334.
2 Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancer Statistics,2017.CA:ACancer JournalforClinicians,2017,67:7-30.
3 Xi Z,Yao M,Li Y,et al.Guttiferone K impedes cell cycle re-entry of quiescent prostate cancer cell via stabilization of FBXW 7 and subsequentc-MYC degradation.CellDeath Dis,2016,7(6):e2252.
4席志超,姚睦,李洋,等.GuttiferoneK抑制静止期前列腺癌细胞重新激活的作用研究.世界中医药,2016,11(7):1171-1175.
5林艳端,申锷,胡兵.三种常见的前列腺癌细胞系LNCap、PC3和DU145的生物学特性.中华临床医师杂志(电子版),2013,7(11):4980-4982.
6 Chen ZH,Zhao R J,LiRH,etal.Bioluminescence imagingofDNA synthetic phaseof cellcycle in livinganimals.PLoSOne,2013,8:e53291.
7 Lu H,Gan M,Cao X,etal.RNAi-mediated silencing of the Skp-2 gene causes inhibition of growth and induction of apoptosis in human renal carcinoma cells.Int JClin Exp Pathol,2014,7:3845-3852.
8罗昆仑.p27与细胞周期调控.国外医学(肿瘤学分册),1998,25(5):262-265.
Effectsof Guttiferone K on Inducing G0/1Arrestof Prostate Cancer LNCaPCells
ZhaiWei1,2,Feng Jiling1,2,XiZhichao1,2,Tan Hongsheng1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)
This study aimed at investigating the effects of Guttiferone K(GUTK),a polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols(PPAPs)compound isolated from Garcinia yunnanensis,on the cell proliferation of human prostatecancer LNCaP cell line.Human prostate cancer LNCaP cells in the period of logarithmic phasewere treated with GUTK. MTT assay was used to detect cell proliferation.Flow cytometry of propidium iodide(PI)staining,BrdU assay and immunocytochemistrywere adopted to analyze the cell cycle phase distribution.Protein levelsofCyclin A,p27 and SKP2 were detected by western blotting.The results showed that GUTK inhibited the proliferation and induced G0/1arrest of LNCaP cells in a time and dose dependentmanner.The protein levels of Cyclin A and SKP2 were decreased,while p27 was increased by GUTK in human prostate cancer LNCaP cells.Itwas concluded thatGUTK,a compound isolated from G.yunnanensis,presented the effect of inhibiting the cell proliferation by inducing G0/1arrest of human prostate cancer LNCaPcells,with potentialanti-prostate canceraction.
Guttiferone K,cell cycle,prostate cancer,anti-cancereffect
10.11842/wst.2017.02.008
R28
A
(责任编辑:朱黎婷,责任译审:朱黎婷)
2017-02-20
修回日期:2017-02-20
*中国博士后科学基金会第60批中国博士后科学基金面上项目(2016M601641):藤黄属PPAPs类化合物抑制前列腺癌复发的活性研究,负责人:席志超。
**通讯作者:谭红胜,副研究员,主要研究方向:中药活性成分研究及中药新药研发。